Проведение исследований в вирусологической лаборатории

План

Краткая характеристика хозяйства

Устройство вирусологической лаборатории

Правила взятия и пересылки материала для вирусологического исследования

Стерилизация лабораторной посуды

Список использованной литературы

Краткая характеристика хозяйства

ЗАО "Рязанский конный завод", расположенный в поселке ВНИИК, Рыбновского района рязанской области, включает в себя молочно-товарную ферму и племенную конеферму.

Общая площадь хозяйства составляет 23 га. Площадь конефермы - 4 га, молочно-товарной фермы - 5 га.

В состав молочно-товарной фермы входит 4 коровника, на 200 голов каждый, для телок, дойных и стельных сухостойных коров, родильное отделения с телятником и бойня.

На молочно-товарной ферме содержится 800 голов крупного рогатого скота черно-пестрой породы (голштинизированные). Из них дойных коров - 405, стельных сухостойных - 35, телок - 260, телят - 100.

В состав конефермы входит конюшня для лошадей тракененской породы, рассчитанная на 100 голов, маточник для лошадей тракененской породы на 100 голов, конюшня для пони шетлендской породы на 50 голов и круг для тренинга.

На племенной конеферме разводят лошадей тракененской породы (гросс-тракены) и пони шетлендской породы. Всего лошадей тракененской породы - 200 голов, шетлендских пони - 50 голов. Из них племенных маток тракененской породы - 100, шетлендских пони - 25; племенных жеребцов тракененской породы - 8, шетлендских пони - 7; ремонтного молодняка тракененской породы - 92, шетлендских пони - 18.

Зоогигиенические нормы содержания животных не соответствуют нормам по всем параметрам.

Хозяйство неблагополучно по бруцеллезу и демодекозу.

Вирусологические исследования проводятся вне хозяйства (в областной лаборатории).

Устройство вирусологической лаборатории

Вирусологическая лаборатория - учреждение, занимающееся изучением вирусов и вирусных заболеваний или производством вирусных препаратов (вакцин, диагностикумов, противовирусных иммунных сывороток и т.п.).

Размеры и штаты вирусологической лаборатории зависят от назначения и объема работы. Но в любом случае обязательным является обеспечение безопасности персонала и возможности проведения работы в стерильных условиях.

Вирусологическая лаборатория состоит из собственно лаборатории и подсобных помещений - для обработки и стерилизации посуды, приготовления питательных сред (для выращивания клеточных культур, выявления бактерий и микоплазм), лиофилизации вирусов, инкубатора, вивария и др. Если вирусологическая лаборатория входит в состав более крупного учреждения (института, санитарно-эпидимиологической станции и т.п.), подсобные помещения могут быть общим для ряда лабораторий или всего учреждения.

Собственно вирусологическая лаборатория строится по типу бактериологической лаборатории с учетом специфики работы - выращивания клеточных и тканевых культур, ультрацентрифугирования, хранения вирусов при низких температурах и др. Она оборудуется для диагностической работы (выделения вирусов и серологических реакций), для изучения свойств вирусов, их структуры, проведения генетических исследований и т.п.

Помещение вирусологической лаборатории должно быть светлым и достаточно просторным, легко мыться и обрабатываться дезинфицирующими растворами, с этой целью стены красят масляной краской или облицовывают плиткой. Пол не должен иметь щелей. Окна лаборатории ориентируют на север или северо-запад. При ориентировке на юг окна завешивают белыми шторами. Помещение оборудуют приточно-вытяжной вентиляцией примерно с 10-кратным обменом воздуха; оно должно быть обеспечено холодной и горячей водой, а также светильным газом. Желательно, чтобы в лаборатории имелась централизованная система сжатого воздуха (давление до 1,0-1,2 атм) и вакуума (до700-760 мм рт. ст. остаточного давления). Должны быть также предусмотрены душевые комнаты для сотрудников. При работе с особо опасными вирусами необходимо обезвреживание (путем кипячения) сточных вод.

В вирусологической лаборатории обязательно наличие отдельного помещения для стерильной работы, состоящего из двух отделений, разделенных стеклянной перегородкой. Внутреннее помещение - бокс - должно быть небольшим (6-8 м²), с низким потолком. Дверь должна открываться в предбоксник, служащий для одевания дополнительной одежды, отделенный второй перегородкой от остального помещения. Для стерилизации бокса и предбоксника используют бактерицидные лампы из увиолевого стекла с преобладающей длиной волны 254 нм. Для этой цели можно использовать лампы БУВ, которые устанавливают из расчета 2-2,5 вт на 1 м³ помещения; средний срок службы лампы 1500 часов. Обязательно обеспечение боксов стерильным воздухом за счет приточной вентиляции при 4-5-кратном обмене; для стерилизации воздуха могут быть использованы фильтры ЛАИК из ткани Петрянова - тип ФПП.

В боксе должны находиться лишь необходимые для работы инструменты и посуда, стерилизатор для инструментов, широкогорлые банки с дезинфицирующим раствором, бак с крышкой для зараженного материала. При работе с возбудителями особо опасных инфекций в боксе устанавливают дополнительно настольный бокс, в котором стерилизуют путем фильтрации как поступающий, так и оттекающий воздух. Основные правила работы с особо опасными возбудителями регламентируются специальной инструкцией.

Для дезинфекции в вирусологической лаборатории используют чаще всего лизол 1-5%, хлорамин 1-5%, формалин 2,5-5%.

Помимо обычной бактериологической посуды, в вирусологической лаборатории должны быть: гомогенизатор для измельчения тканей, магнитные мешалки, микроскопы (световые для исследования в обычном и ультрафиолетовом свете, а также электронные), центрифуги различной мощности (на 3-5 тыс. об. /мин, а также с охлаждением на 12-15 тыс. и 60 тыс. об. /мин), имеющие набор роторов. Необходимы термостаты, одновременно работающие при различной температуре (от 25 до 40?С), в том числе с подачей углекислого газа, или термостатные комнаты. Вирусологическая лаборатория оборудуется рефрижераторами или холодильными камерами с температурой +4, - 20 и - 40?С. Для хранения культур клеток необходимы сосуды Дьюара с жидким азотом или холодильники с температурой ниже - 90?С.

Лаборатории, изучающие биохимию вирусов оборудуют по типу химических. Работа с радиоактивными изотопами производится в специально оборудованном помещении.

В отделениях по приготовлению сред, помимо обычной химической посуды необходимо иметь установки для обработки воды, которая дважды дистиллируется в стеклянных аппаратах или деионизируется на колонках с ионообменными смолами. Для стерилизации растворов, которые нельзя автоклавировать, используют асбестобумажные стерилизующие пластины Зейтца, вмонтированные в фильтры типа Сальникова (Ф-140, ФС-3, ФС-7 и т.п.); фильтрация осуществляется при давлении 0,5 атм.

Рабочий стол вирусолога, по возможности располагают на расстоянии 1 м от окна и покрывают линолеумом или стеклом. На столе помещают газовую горелку. Обязательным оборудованием рабочего места является банка для пипеток с дезинфицирующим раствором (3% раствор карболовой кислоты), закрывающийся фарфоровый или стеклянный сосуд для ваты, набор штативов для пробирок, эмалированные кюветы, пинцеты, ножницы и скальпель, чистые предметные стекла с лунками и без них, а также покровные стекла. Микроскопы хранят в футляре или под стеклянным колпаком. В вирусологической лаборатории также должна быть умывальная раковина, над которой на полке помещают бутыль с раствором для дезинфекции рук.

Виварий должен быть отделен от помещения собственно вирусологической лаборатории. В нем необходимо иметь комнаты для карантина поступающих животных, для их заражения и отдельно для вскрытия. Работа с мелкими лабораторными животными производится за защитным стеклом. Обеззараживание клеток для содержания животных лучше производить паром. Необходимо также иметь крематорий для сжигания трупов животных и мусора.

Устройство областной вирусологической лаборатории, в которую хозяйство направляет материал для исследований, отвечает основным правилам и нормам.

Правила взятия и пересылки материала для вирусологического исследования

Для вирусологических исследований желательно направлять пробы от животных в трех стадиях болезни:

·от свежих трупов (кровь, кость, лимфоузел и пораженные органы);

·от убитых в агонии животных (кровь, кость, лимфоузлы и пораженные органы);

·от выздоравливающих животных (кровь).

Пробы необходимо брать асептически, не допуская их загрязнения, в стерильные флаконы (обычно из-под антибиотиков). Каждую пробу необходимо брать в отдельный флакон. Масса каждой пробы должна быть достаточной для исследования - не менее 5-10 мл, или грамм. Все флаконы должны герметически закрываться пробками (обычно резиновыми), продезинфицированы снаружи, высушены и маркированы. Надписи необходимо делать простым карандашом с указанием вида и номера животного, названия органа и даты взятия материала. Дополнительные данные, относящиеся к анамнезу, заболеваемости, размеру очага или вспышки, симптоматике, применявшимся вакцинам, препаратам и т.п., отражают в специальной карте или сопроводительном письме. Лучшие условия для сохранения проб материалов - замораживание.

Для пересылки образцы должны быть помещены в термосы со льдом или изотермические ящики, приспособленные для пересылки. Если образцы можно доставить в лабораторию в течение суток после отбора, то их не замораживают и не консервируют. Образцы, которые не могут быть доставлена в лабораторию в течение суток или в замороженном виде, необходимо консервировать глицерином. Он должен полностью покрывать кусочки взятых органов. Даже консервированные образцы желательно хранить в холодильнике.

Успешная и точная диагностика зависит от быстроты доставки материалов в лабораторию.

При вспышках заболеваний со значительной массовостью или смертностью из близко расположенных к лаборатории районов кроме образцов материала желательно присылать больных животных или свежие трупы. Их также необходимо доставлять с предосторожностями (упаковывать в ящики или коробки) во избежание разноса инфекции. Образцы материалов от трупов должны быть отобраны в возможно короткие сроки после смерти животного, чтобы сохранить возможности для выделения возбудителя, вызывающего заболевание. В тропическом и субтропическом климате при повышенных температуре и относительной влажности воздуха время от гибели до отбора проб не должно быть более 12 ч.

Взятие проб крови от переболевших животных.

Пробы крови берут из яремной вены у крупного и мелкого рогатого скота, лошадей, из хвостовой артерии у свиней и из подкрыльцовой вены у птиц. Кровь можно брать из ушной вены.

Перед взятием крови необходимо очистить и продезинфицировать кожу в месте укола или разреза. Каждую иглу или лезвие можно использовать только для одного взятия пробы.

Отбор проб костей.

От мелкого животного можно отрезать небольшой кусочек ребра или трубчатой кости, предварительно освободив их от мышечной и хрящевой тканей от крупных животных можно наскоблить ножом или скальпелем ткань красного мозга из любой трубчатой кости, лопатки, позвонков, грудных концов ребер. Для этого нужно обнажить суставную поверхность, срезать хрящ и концом ножа или скальпеля, вращая их, наскрести и поместить во флакон необходимое количество (5-10 г) костно-мозговой ткани.

Целую кость, освобожденную от мышц, посылают в герметически заклеенном пластиковом мешке.

Отбор проб мозга.

Отделить голову от туловища и хорошо зафиксировать. Снять кожу и мышцы с черепной коробки, сделав надрезы между глазными впадинами и от них в сторону затылка. С помощью пилы, топора, ножниц и пинцета снять черепную коробку. Отделить основные нервы, изъять мозг и поместить его на кювету или доску. Отобрать пробы коры больших полушарий и основания спинного мозга.

Для исследования на бешенство необходимо брать пробы аммоновых рогов. Для этого нужно рассечь продольными разрезами каждое центральное полушарие на расстоянии 2 см (для собак) от средней линии мозга, удалить верхние части до щели (пространства), в котором находятся аммоновы рога, представляющие собой полуцилиндрические тела белого цвета.

Нужно взять несколько кусочков аммоновых рогов и основания спинного мозга. Общий вес каждой пробы должен быть 5-10 г. Пробы мозга для исследования на бешенство обычно консервируют глицерином и маркируют с пометкой "Бешенство".

Отбор проб при заболеваниях с поражением эпителиальных покровов (везикулярные поражения).

При заболеваниях, которые вызывают поражение эпителиальных покровов, образование язв и абсцессов (ящур, везикулярный стоматит, оспа, бугорчатка и др.), от живых животных берут пробы крови и эпителий с участков поражения. От павших или убитых животных посылают образцы крови, лимфоузлов, кости и кусочков кожи на границе здоровых и пораженных участков.

Правила отбора, консервирования, и пересылки образцов остаются такими же.

Отбор проб при подозрении на заболевания с признаками поражения нервной системы.

При заболеваниях, сопровождающихся признаками поражений нервной системы (болезнь Тешена, Ауески, отит, риккетсиоз, спорадический энцефаломиелит крупного рогатого окота, бешенство и др.), берут пробы мозга, кости, лимфоузлы, кровь и, при наличии поражений, другие органы.

Следует высылать также кровь от переболевших животных для обнаружения антител в серологических реакциях. Для получения убедительных результатов желательно пересылать пробы крови от большого числа переболевших животных (до 10 проб).

Правила отбора, консервирования и пересылки образцов, если нет подозрения на бешенство, остаются такими же, как было указано ранее.

При подозрении на бешенство необходимо, когда это возможно, присылать целую голову, не прибегая к отбору проб мозга и других образцов. Если в лабораторию посылают целую голову, ее следует завернуть в бумагу, дополнительно упаковать в пластиковый мешок, поместить в не протекающее ведро или жестяную банку и доставить в более короткие сроки.

Отбирать пробы мозга можно только при создании гарантированной безопасности специалистов, работающих с этим материалом, с последующей дезинфекцией рабочего места. Пробы мозга может отбирать только специалист, у которого нет никаких ранений на руках, обязательно резиновых перчатках. Персонал, не участвующий в этой операции, должен находиться на удалении от этого места работы.

В хозяйстве регулярно проводятся диагностические исследования на лейкоз КРС.

Взятие и подготовка материала для диагностического исследования на лейкоз. Для гематологического исследования кровь берут из яремной вены в пробирки с антикоагулянтом - 10% -ным раствором динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА, трилон В) из расчета 0,02 мл раствора на 1 мл крови. Не разрешается брать кровь от животных за 15 дней до отела и 15 дней после него. Для серологического исследования кровь берут от животных в возрасте 6 месяцев и старше. В лабораторию в термосе со льдом направляют 5-6 мл сыворотки. Для гистологического исследования кусочки пораженных органов (селезенки, лимфоузлов, грудной кости, печени, почек, легких, сердца и правого ушка сердечной мышцы, стенки сычуга, матки и скелетных мышц) посылают в свежем виде в термосе со льдом или в 10% -ном растворе формалина.

Стерилизация лабораторной посуды

Стерилизация - обеспложивание; уничтожение в каком-либо материале патогенных и непатогенных микроорганизмов в вегетативной и споровой формах.

Подготовка посуды для стерилизации. Лабораторная посуда должна быть чисто вымытой и простерилизованной. Для мытья используют растворы мыла или химические моющие средства. Новую посуду предварительно кипятят в 1-2% -м растворе соляной кислоты, во избежание последующего выщелачивания стекла. Вымытую в проточной воде посуду ополаскивают дистиллированной водой и высушивают.

вирусологическая лаборатория материал исследование

Бактериологические пробирки. Конические, матровые колбы закрывают ватно-марлевыми пробками, состоящими из плотно скрученных валиков ваты, покрытых слоем марли. Для бактериологических пробирок также разработаны металлические пробки в виде наружных колпачков. Следует учитывать, что стерилизация ватных пробок при высокой температуре приводит к выделению из ваты веществ, ингибирующих рост некоторых чувствительных бактерий, например бруцелл.

При монтаже пипеток в верхний конец вставляют ватный тампон. У пипеток Пастера должен быть запаян капилляр. Каждую мерную пипетку заворачивают длинной полоской бумаги шириной 4-5 см, начиная с носика, винтообразно по всей длине. Пипетки Пастера заворачивают в бумагу по 10-20 штук, пробирки - по 15-20 штук. Все виды пипеток лучше хранить до и после стерилизации в специальных металлических пеналах. Пробки на колбах дополнительно покрывают колпачками из бумаги.

Чистые чашки Петри в собранном виде перед стерилизацией заворачивают в бумагу по 3-4 штуки. После стерилизации бумага предохраняет стерильную посуду от загрязнения микрофлорой.

Посуду перед стерилизацией размещают в сушильном шкафу не слишком плотно, чтобы обеспечить циркуляцию воздуха, и следят, чтобы температура не превышала 180?С, так как при более высокой температуре бумага и вата будут обугливаться. После окончания стерилизации сушильный шкаф не открывают до тех пор. Пока температура в нем не снизится до 70-80?С, поскольку резкий перепад температур может привести к разрушению стекла.

Если посуда предназначена для стерилизации в ней питательных сред автоклавированием под давлением не менее 1 атм, то ее предварительно не стерилизуют. При стерилизации сред текучим паром или в автоклаве под давлением не более 0,5 атм необходимо использовать стерильную посуду.

Стерилизация сухим нагретым воздухом. Метод применяют для стерилизации чистой стеклянной посуды. Для этого используют печь Пастера - специальный сушильный шкаф с двойными стенками. Снаружи он облицован теплонепроницаемым материалом. В верхней его части находится термометр. Между теплонепроницаемой обшивкой и внутренним металлическим корпусом на дне помещен автоматический электронагревательный элемент. При включении сушильного шкафа в электросеть воздух внутри него нагревается. По достижении заданной температуры отмечают время начала стерилизации. Режим стерилизации: при температуре 155-160?С - экспозиция 2 ч, при 165-170?С - 1-1,5 ч, при 180?С - 1 ч. По истечении времени стерилизации нагревание прекращают.

Автоклавирование. Это стерилизация паром под давлением в сочетании с высокой температурой в специальном аппарате - автоклаве. При встрече насыщенного пара с более холодным объектом пар конденсируется, превращаясь в воду, в результате чего выделяется большое количество тепла. Кроме того, уменьшается объем пара, что способствует его проникновению во внутренние части стерилизуемого материала. Обязательное условие - поступление действительно насыщенного пара, чтобы его соприкосновение с холодным предметом вело к немедленной конденсации и нагреванию. Промышленность выпускает вертикальные и горизонтальные автоклавы.

Вертикальный автоклав - это двустенный металлический котел цилиндрической формы, закрываемый герметично крышкой. Между стенками через специальный кран с воронкой заливают воду до определенного уровня. Внутренняя стенка котла в верхней части снабжена отверстиями, в нижней - краном, через который при нагревании воды пар вытесняет воздух из котла. Сверху на автоклав надевают металлический защитный каркас, причем между ним и самим автоклавом должно быть свободное пространство. Автоклав нагревают включением в электросеть.

Автоклав загружают стерилизуемым материалом, закрывают крышку и кран, через который заливали воду, нижний кран временно отваляют открытым. Нагреваемая вода между стенками автоклава кипит, образующийся пар поднимается вверх и через верхние отверстия внутренней стенки проходит внутрь котла, толчками вытесняя воздух через нижний открытый кран. Когда воздух весь вытеснен, и пар начинает выходить ровной струей, нижний кран закрывают. В результате давление пара внутри автоклава повышается. Началом стерилизации считают момент, когда давление достигает заданной величины (по показателям манометра). Нагрев регулируют на протяжении всей стерилизации, поддерживая давление пара на одном уровне. При чрезмерном повышении давления внутри автоклава предусмотрен предохранительный клапан, через который избыток пара автоматически выходит наружу.

При повышении давления пара соответственно повышается и температура в автоклаве.

Манометр показывает давление пара без учета окружающего атмосферного давления (760 мм рт. ст.). По истечении времени стерилизации автоклав отключают. После остывания при нулевом показании манометра открывают кран для спуска пара.

Горизонтальный автоклав отличается от вертикального конструкцией, но принцип действия у него такой же.

Образцы бланков, заполняемых при отправке патологического материала в лабораторию.

Список использованной литературы

1.Кравченко А.Т. "Принципы организации и режим работы вирусологических и риккетсиозных лабораторий".

2.Т.С. Костенко и др. "Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии". Москва, "Колос", 2001 г.

Больше работ по теме: