Получение суперпродуцентов ДНК-полимеразы, РНК-полимеразы, РНК-лигазы, полинуклеотидкиназы фага Т4 и ДНК-полимеразы из Thermus thermophilus HB8

 

ПОЛУЧЕНИЕ СУПЕРПРОДУЦЕНТОВ ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ, РНК-ЛИГАЗЫ, ПОЛИНУКЛЕОТИДКИНАЗЫ ФАГА Т4 И ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ ИЗ Thermus thermophilus HB8

Дипломная работа

Содержание

Введение

. Обзор литературы

.1 Бактериофаг Т4

.2 ДНК-полимеразы

.3 Общие свойства ДНК-полимеразы фага Т4

.4 ДНК-полимераза из T. thermophilus HB8

.5 Полинуклеотидкиназа фага Т4

.6 РНК-лигаза фага Т4

. Экспериментальная часть

.1 Материалы

.2 Методы

.2.1 Амплификация последовательностей генов

.2.2 Очистка фрагментов ДНК

.2.3 Подготовка вектора

.2.4 Подготовка фрагментов ДНК

.2.5 Лигирование

.2.6 Трансформация клеток E. Сoli

.2.7 Анализ клонов

.2.8 Клонирование ДНК-полимеразы фага Т4

.2.9. Индукция экспрессии генов

.2.10 Распределение белка по растворенной и нерастворенной фракциям

.2.11 Выделение Т4 ДНК-полимеразы

.2.12 Выделение полинуклеотидкиназы фага Т4

.2.13 Выделение РНК-лигазы фага Т4

.2.14 Выделение Tth ДНК-полимеразы

.2.15 Определение активности ДНК-полимеразы фага Т4

. Результаты и их обсуждение

.1 Клонирование гена полинуклеотидкиназы фага Т4

.2 Клонирование генов ДНК-полимеразы, РНК-лигазы фага Т4 и Tth-полимеразы

.3 Выделение ДНК-полимеразы и полинуклеотидкиназы фага Т4

.4 Определение активности ДНК-полимеразы фага Т4

.5 Выделение РНК-лигазы фага Т4

.6 Выделение Tth ДНК-полимеразы

.7 Активности РНК-лигазы и полинуклеотидкиназы фага Т4

Выводыписок использованной литературы

Введение

В связи с бурным развитием генной инженерии все больше возрастает значение и масштабы применения ферментов для необходимых манипуляций в этой области. Ферменты репликации ДНК- ДНК-полимеразы, полинуклеотидкиназа и РНК-лигаза фага Т4 приобрели важное значение как инструменты конструирования и изучения рекомбинантных ДНК.

В настоящее время среди полимераз наиболее широко используются ДНК-полимеразы фагов Т4 и Т7, ДНК-полимераза из термофила T. aquaticus. Все большее значение приобретает ДНК-полимераза из T. thermophilus.

Эти ферменты имеют свои аспекты применения и не могут быть полностью взаимозаменяемы в генноинженерных манипуляциях.

Т4 ДНК-полимераза отличается от остальных подобных ферментов тем, что обладает очень высокой корректирующей активностью т.е. редко ошибается, при этом быстро синтезирует новые цепи ДНК. 3'-5'-экзонуклеазная активность в 200-400 раз превосходит аналогичную способность фрагмента Кленова.

Т4 ДНК-полимеразу очень удобно использовать в системе ALTER для сайт-специфического мутагенеза, по этому возникла необходимость клонирования и получения полимеразы фага Т4.

В связи с бурным развитием и применением техники ПЦР огромное значение приобрели термофильные ДНК-полимеразы. Уже известно несколько таких ферментов, но не один из них не является универсальным. По этому выбор полимеразы делается в зависимости от конкретных практических задач.

На что в первую очередь обращают внимание при выборе этого инструмента генной инженерии?

) Термостабильность. Все полимеразы, используемые в ПЦР устойчивы к повышенным температурам. Для них ввели такую характеристику, как время полужизни фермента при температурах 90-100? С. Предпочтение отдается тем полимеразам, у которых этот показатель выше, т.к. появляется возможность увеличения количества циклов в реакции.

) Скорость синтеза ДНК. Проблема амплификации длинных фрагментов ДНК решается с использованием полимераз, способных осуществлять синтез ДНК с высокой скоростью. Одними из таких полимераз являются Stoffel-фрагмент и Tth-полимераза.

) Точность синтеза: в случае клонирования каких-либо генов или фрагментов ДНК становится необходимым предотвращение ошибок в нуклеотидной последовательности синтезируемого фрагмента. Таким образом выбираются полимеразы, способные наиболее точно осуществлять синтез новых цепей ДНК. На данный момент примером могут служить Vent- и Pfu-полимеразы.

) Обратно-транскриптазная активность. В связи с необходимостью получения большого количества кДНК-копий с молекул РНК возникает проблема выбора соответствующей полимеразы. Мезофильные ревертазы иногда "не справляются" со своей задачей, т.к. в РНК могут встречаться устойчивые вторичные структуры. Сравнительно недавно открытая обратно-транскриптазная активность у некоторых термофильных полимераз (Taq, Tth) дает возможность решения данной проблемы.

В нашей лаборатории возникла необходимость амплификации протяженных фрагментов ДНК и получения кДНК-копий с молекул РНК. В связи с этим надо было получить Tth ДНК-полимеразу.

Следующие два инструмента генной инженерии- полинуклеотидкиназа и РНК-лигаза фага Т4. Оба фермента очень широко используются для различных целей. Т4 полинуклеотидкиназа осуществляет фосфорилирование 5/-OH концов ДНК (РНК), что широко применяется при секвенировании ДНК.

РНК-лигаза фага Т4 осуществляет соединение одноцепочечных молекул РНК, ДНК, или РНК с ДНК. Этот фермент широко используется при мечении 3/-концов одноцепочечных нуклеиновых кислот и синтезе олигонуклеотидов с заданной последовательностью оснований. Нашей лаборатории необходим этот фермент в связи с потребностью проводить "заякоренный ПЦР" (anchored PCR). РНК-лигаза- незаменимый фермент, используемый в этом процессе.

Итак, целью нашей работы явилось получение суперпродуцентов ДНК-полимеразы, полинуклеотидкиназы, РНК-лигазы фага Т4 и ДНК-полимеразы из Thermus thermophilus HB8.

Для достижения данной цели необходимо было выполнить две задачи:

1. Разработать универсальный метод клонирования фрагментов ДНК, полученных с помощью ПЦР.
2. Получить важнейшие генетические ферменты, необходимые в нашей лаборатории.

1. Обзор литературы

.1 Бактериофаг Т4

Бактериофаг Т4 относится к крупным фагам Т-четного ряда. ДНК фага Т4 линейная, двухцепочечная, имеет молекулярную массу 120*106, длину 165 тыс. пар оснований., которой достаточно для кодирования примерно 200 генов [1,2]. Было определено положение на генетической карте почти 100 генов фага (рис. 1) [1] . Для молекул ДНК фага характерна концевая избыточность (длина этих участков составляет несколько процентов от всей длины ДНК, т.е. несколько тысяч пар оснований). Молекулы ДНК фага одинаковы по величине и генетическому составу, но гетерогенны по нуклеотидной последовательности (в результате циклических перестановок генов).

Т4- очень крупный фаг, который имеет достаточно полный и независимый репликативный аппарат. В течение одной минуты после адсорбции фага Т4 синтез молекул хозяина почти полностью прекращается, начинается транскрипция некоторых фаговых генов и через 4 минуты уже идет репликация фаговой ДНК. Инфекция фагом Т4- прекрасная модель для изучения контроля репликации и экспрессии генов [1].

Репликация ДНК фага Т4 начинается в точке, расположенной между генами 42 и 43 и идет в двух направлениях. Позже возникает много точек репликации, в результате чего образуется до 60 репликативных вилок.

Одно из преимуществ использования фага Т4 как модельной системы для изучения репликации ДНК заключается в том, что все белки, необходимые для элонгации цепи, кодируются фагом. Идентифицированно 11 белков, участвующих в формировании и передвижении репликативной вилки, но только 5 из них необходимы для создания коровой системы [3]. Это продукты генов 43 (Т4 ДНК полимераза), 32 (белок, связывающий одноцепочечную ДНК), 44, 62, 45 (вспомогательные белки). Взаимодействие этих белков определяет точность репликации [1, 3].

В состав ДНК фага Т4 (и других Т-четных фагов) вместо обычного цитозина. входит необычное основание- оксиметилцитозин (ОМЦ). Большинство остатков ОМЦ глюкозилировано [1,4,5]. ДНК с такими модифицированными основаниями не разрезают почти все известные рестриктазы [4]. Ферменты рестрикции E.coli узнают неглюкозилированные остатки ОМЦ в определенных последовательностях, и разрушают такую ДНК. Т-четные фаги не только защищаются от хозяйских рестриктаз, но и кодируют нуклеазы, деградирующие немодифицированную ДНК хозяина, которые не действуюют на фаговую ДНК.

Гликозилирование остатков ОМЦ в ДНК фага Т4 генетически детерминировано, оно происходит путем переноса гликозильных остатков на ДНК в течение нескольких минут после полимеризации с помощью специфических ферментов - гликозилтрансфераз. Такой способ борьбы мог возникнуть только у такого крупного фага, как Т4 [1].

1.2 ДНК-полимеразы

Ферменты ДНК-зависимые ДНК-полимеразы осуществляют комплементарное копирование матрицы. Первый фермент этого типа был открыт в1956 году у E.coli. Эти ферменты последовательно наращивают конец затравки, присоединяя к нему поступающие нуклеотиды [4].

Биосинтез ДНК имеет две основные особенности:

1. Фосфодиэфирная связь образуется между 3'-гидроксильной группой на конце растущей цепи ДНК, называемой затравкой, и 5'-фосфатной группой очередного дезоксирибонуклеотида. Общее направление роста цепи от 5'-конца к 3'-концу.
2. Каждый дезоксинуклеотид отбирается с помощью спаривания с основанием цепи ДНК, называемой матрицей.

Очередной нуклеотид поступает в реакцию в активированной высокоэнергетической форме дезоксирибонуклеозидтрифосфата. В случае синтеза ДНК присоединение очередного нуклеотида к концу затравки сопровождается гидролизом богатой энергией связи и отщеплением пирофосфата, что делает реакцию в целом энергетически выгодной.

1. Для синтеза ДНК необходима затравка, содержащая 3'-гидроксильную группу, инициация новых цепей невозможна.
2. Под действием 3'-5'-экзонуклеазной активности полимеразы удаляется основание, которое возникает в результате ошибочного встраивания. Таким образом достигается достаточно высокая точность и надежность репликации.
3. Растущая цепь и матрица антипараллельны.
4. Копируется любая последовательность оснований матрицы [1].

В качестве праймера может служить не только ДНКовая но и РНКовая затравка. Т.к. ДНК-полимераза не может осуществлять синтез без затравки, то необходимо, чтобы затравка синтезировалась каким-либо другим ферментом, например, РНК-полимеразой [5].

1.3 Общие свойства ДНК-полимеразы фага Т4

Т4 ДНК-полимераза является ДНК-зависимой ДНК-полимеразой, продуктом гена 43 бактериофага Т4. T4 ДНК-полимераза состоит из одного полипептида молекулярной массы 114 кДа [2].

Фермент катализирует полимеризацию нуклеотидов в направлении 5'-3', обладает очень высокой 3'-5' экзонуклеазной активностью, которая намного более эффективна на одноцепочечной ДНК, чем на двухцепочечной. Полимераза не имеет 5'-3' экзонуклеазной активности. Для работы фермента необходима ДНК с выступающим 5'-концом и высокая концентрация нуклеотидтрифосфатов.

Для своей активности требует ионы Mg2+ . Оптимальный рН 8-9; при рН 7.5 или 9.7 активность составляет только 50%. Фермент не активен при контактировании с двойной цепью как с матрицей. Для полимеразной активности требует одноцепочечную ДНК с затравкой, дуплексную ДНК с разрывами(повреждениями).

Определение единицы активности: Одна единица фермента включает 10 нмоль всех дезоксинуклеотидов в кислотонерастворимые продукты с денатурированной, обработанной ультразвуком ДНК тимуса теленка как матрицей, за 30 мин при 37о С.

Для Т4 ДНК-полимеразы известен PDB-код: 1NOY.

Таблица 1. Свойства наиболее изученных полимераз [1, 6, 7,8,9,10,11,12].

ПолимеразаMr5/-3/ exo3/-5/ exoУровень ошибокНик - трансляцияСкорость удлине-нияТ опт.(?C)ПроцессивностьТемпературная инактива-ция 75?CТермостабильностьДНК-полимераза I E. Coli109++9x10-6+3750+-Фрагмент Кленова-+40x10-6-3712+-T4 ДНК-полимераза114-+<1x10-6-3712+-T7 ДНК-полимераза84-+15x10-6-371000+-Taq-полимераза94+-285x10-6+70-7540-9min 97,5?Фрагмент Стоффела61---3kb/min70-755-10-21min 97,5?Vent-полимераза93-+57x10-6-1kb/min707-8h 95? 2h 100?Pfu-полимераза90+ !1,6x10-60,5kb/min72-1h 95?Tth-полимераза94+->Taq-pol72-

1.4 ДНК-полимераза из T. thermophilus HB8

Tth-ДНК-полимераза является ДНК-зависимой ДНК-полимеразой, состоит из одного полипептида молекулярной массы 94 кДа. Длина полипептидной цепи 834 аминокислотных остатка. Полимераза обладает 5/-3/-экзонуклеазной активностью и не имеет 3/-5/-экзонуклеазной (корректирующей) активности [13].

Оптимум рН для ПЦР с Tth-полимеразой находится в пределах от 8,5 до 9,0 [14]. Присутствие 0,01%-ного Твина-20 значительно повышает эффективность ПЦР c участием этой полимеразы, а добавление 0,01%-ного желатина ингибирует ее. Оптимальная концентрация каждого из пары праймеров для данной системы составляет 0,3 мМ. Показана возможность амплифицировать фрагменты ДНК длиной от 500 до 8500 п. н [14].

Одно из замечательных свойств Tth-полимеразы - способность фермента осуществлять синтез ДНК по цепи РНК в качестве матрицы. То есть было обнаружено, что данная полимераза обладает обратно-транскриптазной (ревертазной) активностью. Этот факт послужил стимулом для использования этого фермента в совмещенной реакции обратной транскрипции и ПЦР (ОТ/ПЦР).

Раньше часто проблематично было синтезировать к-ДНК используя мезофильные вирусные обратные транскриптазы из-за встречающихся в РНК стабильных вторичных структур. Различные методы описывают способы дестабилизации комплементарных районов: использование ДМСО, повышение температуры реакции и некоторые другие. Но добавление в реакционную смесь таких соединений и повышение температуры плохо сказывались на мезофильных ферментах.

Многие проблемы, связанные с большим содержанием вторичной структуры, присутствующей в РНК, минимизировались с использованием термостабильной ДНК полимеразы для обратной транскрипции. Стало возможным получать полноразмерные фрагменты ДНК и сразу амплифицировать их с использованием того же фермента. До Tth-полимеразы для этих целей применяли Taq-полимеразу. Но позже выяснили, что Tth-полимераза в 100 раз более активна в сопряженной реакции ОT/ПЦР [13, 15]. Чувствительность реакции, выполненной с использованием Tth-полимеразы позволяет детектировать (обнаруживать) продукт, полученный со 100 копий синтетической к-РНК [13]. В других работах удалось выявить этим же методом 103 копий РНК интерлейкина 2? (IL-2?) [15] и получить исходя из 400пг суммарной РНК кДНК для мРНКинтерлейкина 1?. Причем слабый сигнал на агарозном гель-электрофорезе наблюдали уже при введении в реакцию 80 пг суммарной мРНК, что эквивалентно 10 клеткам [16].

Эффективность ревертазной стадии ОТ/ПЦР в присутствии различных двухвалентных катионов убывает в ряду: Mn2+ > Cu2+ > Mg2+ > Cd2+ >> Co2+. Показано, что использование Mn2+ вместо Mg2+ на стадии ПЦР приводит к снижению эффективности ОТ/ПЦР. В связи с этим авторы статьи после реакции обратной транскрипции (в присутствии 1 мМ MnCl2) связывали ионы Mn2+ EGTA (так как EGTA имеет более низкое сродство к Mg2+, чем к Mn2+ и другим двухвалентным катионам) и далее проводили ПЦР в присутствии 1,5 мМ Mg2+ [15].

Процесс ОT/ПЦР оказался бесценным для выявления экспрессии генов, для амплификации последовательности РНК, последующего субклонирования и анализа, для диагностики инфекционных агентов или генетических заболеваний [13].

Очень интересна работа Игнатова К.Б с соавторами по рассмотрению различий в свойствах Taq- и Tth-полимераз и их возможная связь с аминокислотной последовательностью субдомена "большой палец" [17].Ранее был проведен сравнительный анализ консервативных областей полимеразного домена различных ДНК-полимераз и показано, что консервативный участок субдомена "большой палец" определяет способность ДНК-полимераз связываться с дуплексом матрица-праймер и влияет на процессивность фермента. Авторы сопоставили аминокислотные последовательности "большого пальца" и прилегающего к нему участка этих полимераз и Tth-полимеразы (рис. 2 ). Был заменен фрагмент Pvu I -BamH I гена Tth-полимеразы, кодирующий 492-595 аминокислотные остатки на соответствующий участок гена ДНК-полимеразы I E. coli, кодирующий 103 аминокислоты (586-688). Удалось получить экспресиию гибридного гена, продукт которого, названный Teco-полимеразой, был активен. В другом случае был заменен фрагмент Pvu I-BamH I гена Tth-полимеразы аналогичным фрагментом гена Taq-полимеразы (рис. 2), что привело к замене всех восьми неидентичных аминокислотных остатков в консервативной области "большого пальца". Новый фермент назвали Ttaq-полимеразой.

Ферментативные активности сравнивались при 72o С для Tth- и Taq-полимераз и при 52o C для Tth- и Teco-полимераз. Было обнаружено, что внесенные мутации не вызвали существенного изменения их удельной активности. Температурный оптимум Tth-, Taq- и Ttaq-полимераз находится в области 70-72o С, а Teco-полимеразы- в области 50-52o С. Tопт Teco-полимеразы на 15o С выше и на 20o С ниже Топт ДНК-полимеразы I E. coli и Tth-полимеразы соответственно. Более высокую, по сравнению с ДНК-полимеразой I E. coli, температуру функционирования Teco-полимеразы авторы объясняют влиянием термостабильных участков. Teco-полимераза является примером возможности создания функционально активных гибридов термостабильной и мезофильной ДНК-полимераз.

В работе показано, что оптимальной концентрацией Mg2+ для Taq-полимеразы является 2 мМ, а для Tth-, Ttaq- и Teco-полимеразы- 5 мМ. Далее была исследована способность полимераз амплифицировать фрагменты ДНК разной длины. ПЦР проводили при 1,5 мМ MgCl2. При амплификации относительно короткого фрагмента ДНК более эффективной оказалась Taq-полимераза, но при амплификации более протяженных участков (больше 5000 п. о.) выход продукта на единицу активности фермента в случае Tth-полимеразы был значительно выше, чем при использовании Taq- и Ttaq-полимераз. Наличие некомплементарного нуклеотида на 3/-конце синтезируемой цепи не влияет на эффективность синтеза ДНК Ttaq-полимеразой. Это свидетельствует о том, что Ttaq- так же, как и Tth-полимераза нечувствительна к наличию 3/-некомплементарного нуклеотида [17].

1.5 Полинуклеотидкиназа фага Т4

Полинуклеотидкиназа фага Т4 (EC2.7.1.78)- продукт раннего гена pseT фага Т4.

Полинуклеотидкиназа катализирует перенос ?-фосфата от АТФ на 5/-OH конец ДНК, РНК или олигонуклеотида . Минимальным субстратом может служить нуклеотид-3/- фосфат [18,19]. Фосфорилирование 5/-концов ДНК с помощью АТФ можно детектировать в экстрактах E. coli, инфицированных фагом Т4 уже через пять минут после инфекции. Максимальный уровень активности фиксируется через 20 минут после инфекции [19].

Фермент так же имеет 3/-фосфатазную активность (удаление 3/-фосфатной группы), которая предпочитает ДНК в качестве субстрата [18].

Было выявлено, что эти две активности катализируются аминокислотными остатками, локализующимисяся в разных активных сайтах полипептидной цепи [20]. Специфическое расщепление экзопептидазой выявило, что киназная активность находится в N-концевой части, а фосфатазная активность- в С-концевой части полипептидной цепи. С помощью частичного расщепления трипсином был получен фрагмент белка 29 кДа, который не обладал киназной активностью, но имел почти нормальную 3/-фосфатазную активность [20].

Реакцию, катализируемую полинуклеотидкиназой фага Т4 можно представить следующим образом:

АТФ + 5/-OH ДНК (РНК) ? АДФ + 5/-Ф ДНК (РНК)

Физико-химические свойства полинуклеотидкиназы.

Фермент является олигомером, состоит из четырех идентичных субъединиц (мономеров), каждая из которых сама по себе не обладает плинуклеотидкиназной активностью. Молекулярная масса мономера 33 кДа, что было определено с помощью аминокислотного анализа и SDS-гель-электрофореза [21]. Гель-фильтрацией была определена молекулярная масса активной полинуклеотидкиназы-140 кДа.

Фенилаланин является N-концевой аминокислотой. Каждый мономер содержит две SH-группы. Высокая ионная сила раствора (0,1М KCl), спермин, АТФ, тимидин-3/-монофосфат являются компонентами, стабилизирующими олигомерную структуру фермента [21].

Оптимальным рН для реакции фосфорилирования является 7,4-8,0 в Трис-буфере. При рН 7,6 в 0,07 М Na- или К-фосфатном буфере наблюдается лишь 5%-ная активность, по сравнению с активностью в Трис-буфере.

Необходимо присутствие катионов двухвалентных металлов. Оптимальная концентрация Mg2+ в реакционной смеси- 10мМ. Mn2+ может лишь частично заменять Mg2+. При использовании Mn2+ в оптимальной концентрации 3,3 мМ сохраняется 50% активности, наблюдаемой в присутствии Mg2+. В отсутствии ?-меркаптоэтанола наблюдается активность, соответствующая двум процентам от максимальной активности [21].

Оптимальный рН для дефосфорилирования 3/-концов равен 6,0. Фосфатазная активность не требует присутствия АТФ, более эффективна при взаимодействии фермента с дезоксирибонуклеотидами, чем с рибонуклеотидами. Максимальная фосфатазная активность проявляется при концентрации Mg2+ от 3 до 10 мМ. Ионы Mg2+ могут быть заменены ионами Co2+ без заметных изменений в скорости реакции. Но Mn2+, Zn2+ илиCa2+ не способны заменить Mg2+. Не смотря на то, что сравнительно низкая фосфатазная активность наблюдается уже при рН 8,0, перенос 3/-фосфатов с концов олигорибонуклеотидов зафиксирован даже при рН 10,0 [22].

Было установлено, что реакция фосфорилирования обратима. Это можно определить по появлению [?-32P]АТФ из [5/-32P]-меченного олигонуклеотида в присутствии АДФ. Акцептором фосфата может быть не только АДФ, но и АТФ, в результате чего образуется [?-32P]аденозинтетрафосфат [23]. Отимальный рН для этой реакции 6,0.

Сравнение свойств полинуклеотидкиназы фага Т4 и полинуклеотидкиназы из ядер печени крысы.

Полинуклеотидкиназа из ядер печени крысы значительно отличается по своим физико-химическим свойствам от соответствующего фермента фага Т4. Молекулярная масса фермента 80 кДа. Это односубъединичный белок. Оптимальный рН для функционирования 5,5, хотя заметная активность проявляется до рН 8,0. По результатам проведенных опытов можно сделать вывод, что фермент в основном локализован в ядрах клеток [24]. Киназа из ядер печени крысы неактивна на 5/-OH-концах молекул РНК или олигодезоксирибонуклеотидах короче 10-12 оснований. Для этого фермента можно более точно написать уравнение катализируемой реакции:

/-OH конец ДНК + АТФ ? 5/-фосфат конец ДНК + АДФ

Этот фермент способен фосфорилировать 5/-OH концы как одноцепочечных молекул ДНК, так и концы или ники в двухцепочечных молекулах [25]. Ионы Mg2+, Mn2+, Co2+, Zn2+, Ni2+, Ca2+ поддерживают высокую активность фермента , в то время как ионы Cu2+ являются ингибиторами. Обычным субстратом для измерения активности этой киназы является одноцепочечная ДНК длиной 100-200 п. о.[25].

Функция полинуклеотидкиназы в клетках млекопитающих остается неясной. Возможно, она играет особенную роль в репарации поврежденной ДНК в кооперации с полинуклеотид лигазой [24].

Использование полинуклеотидкиназы фага Т4

1) Киназная и фосфатазная активности фермента при желании могут быть использованы независимо. При инкубации в отсутствии АТФ 3/-фосфат можно убрать с ДНК или РНК без разрушения 5/-фосфата. Если олигонуклеотид с 3/-фосфатом инкубировать в присутствии фермента и АТФ при рН 9,0 (или выше) ограниченное время, то 5/-фосфат может быть введен не затрагивая основной массы 3/-фосфатов [22].

) 5/-концевой гидроксил полинуклеотида может быть мечен как с помощью прямой реакции, так и с помощью реакции обмена, которую фермент катализирует в присутствии [?-32P]АТФ и АДФ [26]:

5/-ОН-конец + АТФ ? 5/-Фосфат-конец + АДФ

Таким образом можно использовать обратную реакцию для прямого мечения 5/-фосфорилированных концов двухцепочечных нуклеиновых кислот избегая предварительного дефосфорилирования [27].

Киназную реакцию можно ускорить (улучшить) добавлением ПЭГ, что может обеспечить более эффективную реакцию при очень низких концентрациях субстрата [26].

) Разработан быстрый и количественный метод измерения активности эндонуклеаз рестрикции второго класса. Он позволяет количественно определить число сайтов разрезания эндонуклеазой на молекуле ДНК. Число образуемых фрагментов в молях может быть определено по количеству включенной в нуклеотидную цепь радиоактивности, т. к. величина введенной метки 32Р пропорциональна числу образующихся концов ДНК и не зависит от количества нуклеотидов в ней [28, 29].

1.6 РНК-лигаза фага Т4

Т4 РНК-лигаза была открыта в 1972 году в лаборатории of Hurwitz. Фермент был обнаружен как активность, катализирующая циклизацию гомополирибонуклеотидов с 3/-концевым гидроксилом и 5/-концевым фосфатом с образованием 3/-5/ фосфодиэфирной связи [30]. РНК-лигаза (ЕС 6.5.1.3) продуцируется клетками E. coli, зараженными фагом Т4. Фермент катализирует АТФ-зависимое внутри- и межмолекулярное образование фосфодиэфирной связи между 5/-фосфат и 3/-гидроксильным концами РНК. Реакция сопровождается гидролизом АТФ до АМФ и пирофосфата. [31,32,33]. Фермент может осуществлять межмолекулярную реакцию как с РНК, так и с ДНК. В 1977 году было показано, что РНК-лигаза является продуктом гена 63 (gp63) фага Т4 и что этот же фермент осуществляет присоединение хвостового отростка к базальной пластине фага [31,34].

Физические свойства РНК-лигазы

Молекулярная масса фермента по данным SDS-электрофореза колеблется от 41 до 45 кДа. В неденатурирующих условиях масса составляет 47 кДа по результатам гель фильтрации и 48,2 кДа по данным седиментационного ультрацентрифугирования.

Изоэлектрическая точка для фермента 6,1. Поглощение раствора белка при концентрации 1 мг/мл и длине волны 280 нм составляет 1,3 [31].

Реакции, осуществляемые РНК-лигазой.

1. Е + АТФ « Е-рА + РРi
2. Е-рА + рNn « Е [A5/ pp5/ Nn]
3. Е [A5/ pp5/ Nn] + Mm « MmpNn + AMФ + Е

А. Прямая межмолекулярная реакция.

Рисунок 3 Показывает механизм прямой межмолекулярной реакции. Олигорибонкулеотид А3 с 3/-ОН концом (называемый акцептором) присоединяется к 5/-фосфорилированному донору рСр. Изучение субстратной специфичности фермента позволило сделать вывод, что в РНК-лигазе содержится как минимум 3 сайта, связывающих нуклеотиды. Первый сайт связывает АТФ, второй связывает акцептор, содержащий реактивный 3/-гидроксил и третий связывает донор, несущий 5/-фосфат для связывания с акцептором.

Cубстрат-связывающие сайты фермента имеют разную специфичность.

Донорный сайт связывает остаток нуклеозида и его две ассоциированных фосфатных группы с наименьшей специфичностью к нуклеозиду.

Акцепторный сайт связывает 3 нуклеозида и 2 фосфата. При этом выявляется сильное предпочтение к рибонуклеозидам, в сравнении с дезоксирибонуклеозидами.

АТФ-связывающий сайт высоко специфичен относительно аденозиновой части молекулы АТФ[31].

1. Аденилирование фермента с АТФ с освобождением пирофосфата- первое событие, происходящее в процессе образования фосфодиэфирной связи. Эта реакция может происходить в отсутствии донора и акцептора. Аденилированный фермент может освобождаться в присутствии пирофосфата с восстановлением АТФ. Аденилированный фермент можно отделить от свободного с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии SDS [31,34]. Один моль АТФ связывается с одним моль фермента.

2)Образование аденилированного донора. Адениловая-группа переносится с фермента на 5/-фосфат донора. Образование 5/?5/ ангидридной связи активирует 5/-фосфат донора для последующей реакции. Образование активированного донора стимулируется присутствием акцептора.

Акцептор является не только субстратом в реакции, но и кофактором для аденилирования молекулы донора. В отсутствии 3/-OH группы активированный промежуточный продукт не образуется [35] Стимулирование акцептором переноса аденила с фермента на донор может служить для согласованной реакции, чтобы убедиться, что акцептор находится на поверхности фермента, когда донор активируется. Но, когда в реакции мало акцепторов, активированный донор может диссоциировать с фермента [36,37,38].

Субстратная специфичность по отношению к молекуле донора в реакции аденилирования может быть определена невпрямую, а по всей реакции соединения. Рибонуклеозид 3/-5/-бифосфат может служить субстратом, тогда как 5/-нуклеозид монофосфат- нет, даже если последний имеет 5/-фосфат. Таким образом, по крайней мере остаток из одного нуклеотида и 3/-фосфат необходимы для того, чтобы служить донором. Второй фосфат должен быть на 3/-гидроксильном конце, т. к. рибонуклеозид 2/,5/-бифосфат не участвует в реакции. Сайт связывания донора, возможно, не выходит за пределы начального 5/-pNp района донора, т. к. скорость реакции с серией гомологичных доноров pAnp c одним и тем же акцептором почти одинакова.

ДНК может присоединяться в качестве донора, но для успешного осуществления реакции необходимо уменьшить температуру инкубации (ниже обычных 37o), увеличить количество фермента и увеличить время инкубации [39]. Донор такой же длины, что и ДНК ?Х174, может служить субстратом для РНК-лигазы.

Эффект нуклеотидного состава донора на скорость реакции: с пиримидиновыми pNp в 2-10 раз лучше, чем с их пуриновыми парами. Разрешаются модификации в сахаре, в основании и 5/-фосфате. В общем, оказывается, что чем больше основание в pNp, тем меньше реактивность в качестве субстрата, то есть эффективность донора : пиримидин > пурин > модифицированный пурин.

)Образование фосфодиэфирной связи. 3/-гидроксил молекулы акцептора вытесняет АМФ из активированного донора и образует фосфодиэфирную связь. Активированный донор, как выделенный из реакционной смеси с РНК-лигазой, так и синтезированный химически, взаимодействует с акцептором в отсутствии АТФ с образованием фосфодиэфирной связи и освобождением АМФ. Реакция освобождения АМФ координирована с образованием олигонуклеотидов. Один АМФ освобождается при образовании одной фосфодиэфирной связи.

Образование фосфодиэфирной связи продукта требует свободного от АТФ фермента. Добавление АТФ в реакцию изолированного аденилированного донора и акцептора уменьшает образование продукта. Предполагается, что аденилированный фермент неактивен в третьей реакции.

Тринуклеозид дифосфат-является олигонуклеотидом минимального размера, который может служить акцептором. Различные динуклеозид монофосфаты, например, GpG, UpI и pA2 могут быть присоединены к соответствующим донорам. Акцепторы, имеющие длину более трех остатков, не увеличивают выход реакции. Видимо, акцепторный сайт РНК-лигазы узнает 3 нуклеотида и 2 фосфата. В реакции могут участвовать молекулы, сравнимые по размерам с рибосомальной и вирусной РНК.

Обнаружена зависимость эффективности акцептора в реакции от крайнего основания в молекуле акцептора ("эффект крайнего основания"). "Лучшие" акцепторы- гомополимеры и олигомеры, содержащие адениновые остатки, тогда как акцепторы, содержащие С или U, и только U, являются "худшими". Видимо, из-за того, что тримеры UAG и AUG реже встречаются, чем AAG, фермент проявляет дискриминацию по отношению к уридиновым остаткам в любых трехнуклеотидных акцепторных сайтах. Для иллюстрации величины инактивирующего эффекта для уридиновых остатков приводится тот факт, что для добавления донора к U3 необходимо в 30 раз больше времени, чем в том же случае по отношению к А3 [31].

Больший эффект наблюдается при тестировании ДНК в качестве акцептора. С олигонуклеотидами dA4 реакция протекает в 200 раз медленнее, чем с rA4, при одинаковых молекулах донора. Для соединения ДНК пока невозможно добиться большей скорости, чем 2 превращения в час. Причина такой низкой активности ДНК неясна. Видимо, 2/-гидроксил косвенно вовлечен в реакцию. Добавление одного 3/-концевого рибонуклеотида к дезоксирибонуклеотиду увеличивает реактивность последнего, и наоборот, добавление дезоксирибонуклеотида к 3/-концу рибонуклеотидного акцептора делает его менее активным.

Двухцепочечные структуры часто ингибируют реакцию, катализируемую РНК-лигазой. В разных случаях получаются различные результаты. В одних случаях дуплексные структуры не могут связываться с донорным или акцепторным сайтом фермента, тогда как в других случаях связывание происходит без особых осложнений. Пока никакой ясной картины этого феномена не наблюдается.

В. Реакция циклизации (внутримолекулярная реакция).

Эту реакцию можно рассматривать как частный случай межмолекулярной реакции, в которой донор и акцептор являются частью одной молекулы. Так как. взаимодействие концов одной молекулы более вероятно, чем взаимодействие концов разных молекул, то внутримолекулярная реакция идет быстрей, с затратой меньшего количества фермента, по ставнению с межмолекулярной реакцией.

"Эффект крайнего основания" такой же, как и при межмолекулярной реакции.

Эффект длины. Кольцевые молекулы не могут образовываться, если они слишком коротки, или слишком длинны (низка вероятность взаимодействия концов олигорибонуклеотидов). Изучение этой проблемы позволило сделать вывод, что самым коротким олигомером в реакции может быть молекула из 8 нуклеотидов [31,36]. Скорость реакции увеличивается до максимальной при длине полимеров в 10-16 нуклеотидов, но при дальнейшем увеличении длины скорость реакции уменьшается. Аналогично для цепи ДНК: самым коротким олигомером может служить цепь из 6 остатков. Скорость наиболее высокая при 8-20 членном олигомере и низкая уже при длине в 30 оснований. Как и межмолекулярная реакция, циклизация требует присутствия АТФ (именно dATФ!) [31].

Реакция циклизации является основой для определения активности фермента. Циклизация [5/-32P]олигоаденилата детектируется по устойчивости концевого фосфата с последующей обработкой щелочной фосфатазой.

Единица активности РНК-лигазы определяется как включение 1 нмоль олиго(А) в фосфатаз- устойчивую форму за 30 мин при 37° С [33].

С. Обратная реакция (Reversal of T4 RNA ligase)

Обратная реакция была обнаружена по появлению несоответствующих ожидаемым продуктам реакции. В работе [40] показали, что возможен обратный ход второй и третьей реакции. В итоге обратная реакция включает перенос 3/-концевого (например, pCp) остатка с одного олигомера на другой:

A3Cp + ACG ® A3 + ACGCp

Эта реакция стимулируется добавлением АМФ , но никаким другим 5/-нуклеозид дифосфатом. АТФ ингибирует обратную реакцию, т. к. образуется аденилированный фермент [31].

Не смотря на то, что не было сделано прямого сравнения, очевидно, что обратимость последних реакций синтеза олигомеров может происходить со скоростями, сравнимыми со скоростью прямой реакции. Это отличительная реакция РНК-лигазы фага Т4, в сравнении с Т4 ДНК лигазой, которая катализирует обратную реакцию с гораздо меньшей скоростью, чем прямую.

Обратная реакция может привести к трудностям при использовании РНК-лигазы в синтезе олигонуклеотидов.

Сравнение свойствТ4 РНК-лигазы с ДНК-лигазой фага Т4

Механизм реакции с РНК-лигазой аналогичен реакции, катализируемой Т4 ДНК лигазой [31]:

1. В обоих случаях комплекс фермент-АМФ удерживается фосфоамидной связью.
2. Оба фермента активируют 5/-фосфат донора с помощью переноса на него АМФ и образуя ангидридную связь.
3. Третий шаг в реакции включает вытеснение АМФ и образование фосфодиэфирной связи в продукте реакции.
4. РНК-лигаза предпочитает РНК-субстрат, тогда как ДНК-лигаза предпочитает соединять молекулы ДНК.

Биологическая роль продукта гена 63 фага Т4

РНК-лигазная активность детектируется через 3 минуты после инфекции клеток фагом, что позволяет рассматривать этот белок как ранний. В мутантах, дефектных по репликации ДНК, РНК-лигаза накапливается с различными другими ранними белками. Это указывает на то, что РНК-лигаза находится под контролем гена regA, который является посттранскрипционным репрессором ранних функций. Таким образом, можно предположить, что РНК-лигаза может быть необходима на ранних стадиях инфекции, возможно, в ДНК-репликации или в выключении клеток хозяина.

Продукт гена 63 является одним из белков, обеспечивающих сборку фага, но не входящих в состав фаговых частиц. Присоединение хвостовых нитей (TFA, tail fibre attachment) к базальной пластинке нековалентно, не требует АТФ и ионов Mg2+ , может происходить в отсутствии РНК-лигазы с низкой скоростью. Было показано, что продукт гена 63 появляется как на ранних, так и на поздних стадиях инфекции. Это подтверждает участие фермента в сборке вируcных частиц [31].

Установлено, что две активности РНК-лигазы не связаны между собой. Было показано, что несколько мутантов по гену 63, названных rli не имели РНК-лигазной активности, но нормально присоединяли хвостовые отростки [30,33,41]. В частности, один из амбер-мутантов (в С-концевой части белка) не имел РНК-лигазной активности, но обладал TFA-активностью [33].

Функция РНК-лигазы in vivo все еще остается неясной. Но можно сделать несколько предположений о биологической роли этого фермента:

1. Возможно, что in vivo она участвует в репарации РНК или в предотвращении экзонуклеазного расщепления РНК (образованием кольцевого полирибонуклеотида) [30].
2. Способность фермента соединять молекулы РНК указывает на возможность его участия в рекомбинации молекул РНК [30].
3. Образование сополимеров РНК-ДНК может происходить in vivo
4. РНК-лигаза- является продуктом гена 63, который может катализировать присоединение базальных пластинок фага Т4 при его сборке.
5. Есть предположение, что РНК-лигаза больше участвует в метаболизме ДНК, нежели в РНК-процессинге [41].
6. Есть версия, что РНК-лигаза участвует в процессинге т-РНК.

Видимо, РНК-лигаза является многофункциональным ферментом.

Применение РНК-лигазы фага Т4

1. РНК-лигаза широко используется для синтеза олигорибонуклеотидов заданной последовательности оснований [31, 42]. При этом в качестве доноров используются олигонуклеотиды с блокированными 3/-концами, т. к. олигомеры с длиной больше, чем 8 оснований, могут участвовать во внутримолекулярной реакции, образуя циклические соединения . Разрешение проблемы -использование 3/-фосфорилированного донора или химическая модификация 2/- или 3/-гидроксильной группы концевого нуклеотида донора [42].
2. Способность РНК-лигазы соединять одноцепочечные молекулы ДНК может использоваться для синтеза олигодезоксирибонуклеотидов [43].
3. С помощью РНК-лигазы можно производить радиоактивное мечение 3/-концов молекул РНК. В реакции используется [5/-32P]pNp в качестве донора и РНК как акцептор. Эта реакция получается аналогичной мечению 5/-конца цепи РНК in vitro с помощью полинуклеотидкиназы и [?32P]ATФ, и может быть использована в ситуации, когда 5/-концевое мечение невозможно [44].
4. Получение модифицированных нуклеиновых кислот при использовании модифицированных pNp [31,44].
5. Разработан метод амплификации фрагментов ДНК, содержащих последовательность определенного гена и примыкающую к нему 5/-некодирующую область (так называемый "заякоренный ПЦР"- anchored PCR). В данном случае делают ПЦР с геномной ДНК или кДНК с использованием одного специфического праймера (А) к 3/-концу определенного гена. К 3/-концу одноцепочечного продукта реакции (последовательность этого конца неизвестна) "пришивается" лигируется олигонуклеотид В (с любой выбранной последовательностью нуклеотидов) с помощью Т4 РНК-лигазы (рис. 4). Затем для получения двухцепочечного фрагмента проводится ПЦР с использованием праймеров А и С ( С комплементарен праймеру В) . Далее можно лигировать полученный фрагмент с вектором [45].

2. Экспериментальная часть

.1 Материалы

В работе использовались следующие реактивы: NaCl, KCl(о.с.ч ) , MgCl2, HClO4, KH2PO4, K2HPO4, NaOH, Трис-основание (Serva, Германия), БСА, ДТТ, АТФ (Sigma, США), ЭДТА (о.с.ч), бромид этидия (Serva, Германия), агароза (Bio-Rad, США), легкоплавкая агароза (Sigma, США), бактопептон, бактотриптон, глицерин, ацетат натрия, (NH4)2SO4, полиимин Р (BRL, США), фенилметилсульфонилфторид, дрожжевой экстракт (Difco, США), дезоксинуклеотидтрифосфаты (Sigma,США), [?-32P]ATP, желатина, гуанидинтиоционат (Fluka), изопропил ?-D-тиогалактозид (IPTG), "стеклянное молочко"-silica (Merc, Германия), фенол, этанол,хлороформ, изопропанол, имидазол, NiSO4.

Реактивы для белкового электрофореза: акриламид, N,N'метилен-бисакриламид, персульфат аммония (Reanal, Венгрия),ТЕМЕД, Кумасси G250 (Serva, Германия), ?-меркаптоэтанол, додецилсульфат натрия (SDS).

Белки и ферменты: сайт-специфические эндонуклеазы BspIS4 I, Xho I, Nco I, Nsi I, Sph I, BspLu11 II, Bli736 I, Paq I, термостабильные ДНК-полимеразы Taq и Pfu, лизоцим, ДНК-лигаза фага Т4

Препараты ДНК: ДНК бактериофага Т4 (частично глюкозилированная), в качестве вектора для клонирования использовали плазмиды pET-21d и pET-28b

Штамм E.coli BL21DE3: F- ompT[Ion] hsdSB (rB-mB-, E.coli B штамм, ? профаг, несущий ген Т7 РНК-полимеразы.

В работе использовались центрифуги: "Eppendorf", "Janetzki K23", прибор для проведения ПЦР "Mastercycler gradient" (Eppendorf).

Для проведения электрофорезов использовались: источники питания ИПФ-1, ИПФ-2; аппараты для электрофореза, изготовленные в мастерских Института Белка РАН.

Для выделения ДНК из легкоплавкой агарозы использовались стеклянный фильтр Glass microfibre paper (GMP) (Whatman, Англия), 60% спирт (100mM NaCl, 10mM Tris, pH 7.5, 1mM ЭДТА).

Бактериальные жидкие среды:

LB: 1% бакто-триптон (Difco, США), 0.5% дрожжевой экстракт (Difco, США), 1% NaCl, pH 7.0;

SOC-среда: 2% пептон, 0,5% дрожжевой экстракт, pH 7.0, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM глюкозы.

Буферные растворы:

Буфер К (для приготовления компетентных клеток): 10 mM Tris-HCl (pH 7,6), 70 mM CaCl2, 50 mM MgCl2.

Среднесолевой буфер MRB: 20 мМ Трис-HCl, pH 7.5, 50 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2, 10 mM DTT, 1 мг/мл.желатина

Высокосолевой буфер HRB: 20 мМ Трис-HCl, pH 7.5, 100 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2, 10 mM DTT, 1мг/мл желатина.

LIGB буфер для ДНК-лигазы фага Т4: 50 мМ Трис-HCl, pH 7,8, 10 мМ MgCl2, 10mM DTT, 1мМ АТФ, 25 мкг/мл БСА.

TE: 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM ЭДТА: 89 mM Tris-борат, 2 mM ЭДТА.

Х TermoPol буфер для Taq- и Pfu-ДНК-полимераз: 10 mM KCl, 20 mM Tris-HCl ( pH 8,8), 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0,1% Triton X-100.

Хроматографические носители:

Фенил-сефароза, гепарин-сефароза, голубая агароза (Институт химии, Таллин), Ni2+-NTA-агароза.

Антибиотики: ампициллин, канамицин.

Олигонуклеотиды:

F1 5/-CTAAGGAAGACTCCATGAAAGAATTTTAT-3'

F2 5/-CTAAGGAAGACTCCATGAAAGAATTTTAT-3'

С8 5'-AATTCATGAAAAAGATTATTTTG-3'

С5 5'-GCCTCGAGAAAATCTCCCGAAGC-3'

В11 5'-GCGGTCTCGCATGCAAGAGCTTTTTAAC-3/'

B12 5'-GGGCTCGAGGTATCCTTCTGGGATA -3'

А9 5/- GCCGGTCTCCCATGGAGGCGATGCTTCCG-3/

А8 5/-CCGGAATTCTAACCCTTGGCGGAAAGC-3/

Олигонуклеотиды синтезированы фирмой "СИНТОЛ", г. Москва.

2.2 Методы

2.2.1 Амплификация последовательностей генов

Для амплификации фрагмента, содержащего последовательность гена 43, проводили полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в 20 мкл реакционной смеси.

Были синтезированы следующие олигонуклеотиды:

F1(к 5'-области гена)5'-CTAAGGAAGACTCCATGAAAGAATTTTAT-3'

F2(к 3'-области гена)5'-CTAAGGAAGACTCCATGAAAGAATTTTAT-3'

Реакционная смесь содержала: 11,9 мкл Н2О, 2мкл 10x Taq-буфера, олигонуклеотидов-праймеров по 20 пмоль каждого, 2 нг ДНК фага Т4, 0,4 мкл раствора дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (конечная концентрация каждого dNTP в реакционной смеси 200мкM), 1 мкл смеси полимераз (Taq и Pfu ).

Был подобран оптимальный температурный режим, составлена программа для прибора (Termal cycler ).

) Денатурация 950 3 мин

) Денатурация 950 30 сек

) Отжиг праймеров 340 30 сек

) Элонгация 720 3 мин

) Повторение цикла (пункты 2-4) 3 раза

) денатурация 950 30 сек

) отжиг праймеров 600 30 сек

) элонгация 720 3 мин

) повторение цикла(пункты 6-8) 20 раз

) финальная элонгация 720 5 мин

Температура отжига рассчитывалась для комплементарной части и для полной последовательности олигонуклеотида по формуле: Тm= 20( А-Т )+40( G-C ).

Использовали при проведении ПЦР смесь полимераз Taq+Pfu для точного и быстрого синтеза комплементарных цепей ДНК. Время элонгации вычислялось исходя из скорости работы Taq- и Pfu-полимераз. Taq-полимераза достраивает примерно 1000 оснований за минуту, Pfu- тоже самое выполняет примерно за 2 минуты. Так как основной синтез выполняет Taq-полимераза, то рассчет времени элонгации вели исходя из величины амплифицируемого фрагмента ( 2696 пар оснований) и скорости синтеза ДНК, равной 1000 оснований в минуту.

Амплификация последовательности гена полинуклеотидкиназы фага Т4

Были синтезированы следующие олигонуклеотиды:

С8 (к 5'-области гена) 5'-AATTCATGAAAAAGATTATTTTG'

С5 (к 3'-области гена) 5'-GCCTCGAGAAAATCTCCCGAAGC-3'

Программа:

) Денатурация 95o 5 мин

) Денатурация 95o 30 сек

) Отжиг праймеров 51o 30 сек

) Элонгация 72o 2 мин

) Повторение цикла (пункты 2-4) 25 раз

) финальная элонгация 72o 4 мин

Амплификация последовательности гена РНК-лигазы фага Т4

Олигонуклеотиды:

В11(к 5'-области гена)5'-GCGGTCTCGCATGCAAGAGCTTTTTAAC-3/'

B12(к 3'-области гена) 5'-GGGCTCGAGGTATCCTTCTGGGATA -3'

Температурный режим:

) Денатурация 95o 5 мин

) Денатурация 95o 30 сек

) Отжиг праймеров 55o 30 сек

) Элонгация 72o 2 мин 20 сек

) Повторение цикла (пункты 2-4) 24 раза

) финальная элонгация 72o 4 мин.

Амплификация последовательности гена Тth-полимеразы

Были синтезированы следующие олигонуклеотиды:

А9 (к 5/-концу ) 5/- GCCGGTCTCCCATGGAGGCGATGCTTCCG-3/

А8 (к 3/-концу) 5/-CCGGAATTCTAACCCTTGGCGGAAAGC-3/

Программа:

) Денатурация 95o 5 мин.

) Денатурация 95o 30 сек.

) Отжиг праймеров 75o 30 сек.

) Элонгация 72o 2 мин 40 ceк.

) повторение цикла (пункты 6-8) 34 раза

) финальная элонгация 72o 4 мин.

клонирование эндонуклеаз рестрикция фаг

2.2.2 Очистка фрагментов ДНК

Для очистки амплифицированных фрагментов ДНК от белков и продуктов неспецифического синтеза ДНК использовали методику выделения ДНК из геля . Проводили электрофорез в легкоплавкой агарозе, затем вырезали участок геля, в котором содержался нужный фрагмент ДНК. Помещали его в прбирку Eppendorf на 2 мл, заливали полностью 4М гуанидинтиоционатом (растворение агарозы), добавляли раствор silica (Merk, Германия) и инкубировали 20 мин при 56o С. Затем центрифугировали 1 мин при 3000 об/мин. Осадок стекла ресуспендировали в 200 мкл гуанидинтиоционата, опять центрифугировали 1 мин при 3000 об/мин. Точно так же осадок промывали 60% этанолом 3 раза (М Трис-HCl, ). Осадок высушивали, добавляли необходимое количество воды, инкубировали 20 мин при 56o С (элюирование ДНК со стекла). Центрифугировали 3 мин при 3000 об/мин, отбирали супернатант (раствор ДНК).

2.2.3 Подготовка вектора

Использовали плазмиды pET-21d и pET-28b, в полилинкере которых есть сайты для рестриктаз NcoI, XhoI и EcoRI. Для клонирования генов ДНК-полимеразы и РНК-лигазы фага Т4 использовали вектор pET-21d, обработанный эндонуклеазами NcoI и XhoI. Ген Т4 полинуклеотидкиназы клонировали в pET-28b, обработанную теми же эндонуклеазами. Для клонирования гена Tth-полимеразы использовали плазмиду pET-21d, обработанную рестриктазами NcoI и EcoRI. Расщепление проводили одновременно в двух пробах с разными рестриктазами для того, чтобы можно было проследить за полнотой гидролиза ДНК каждым ферментом. Для расщепления вектора внесли 12 мкл (7мкг) ДНК pET-21d (pET-28b), 12 мкл десятикратного буфера для рестрикции (МRB), добавили воды до объема смеси 120 мкл. Из этой смеси отобрали 20 мкл (как контроль), оставшееся количество поделили пополам (по 50 мкл). В одну пробу добавили рестриктазу XhoI (EcoRI), в другую- NcoI. Инкубировали при 37o C 3 часа. Проводили инактивацию ферментов прогреванием при 65o C 20 мин. Полноту гидролиза оценивали по электрофорезу. После полного расщепления вектора первыми рестриктазами, к смеси добавляли вторые рестриктазы (к образцу с плазмидой, расщепленной по сайту XhoI (EcoRI), добавляли NcoI, и наоборот), инкубировали образцы при 37oC 3 часа. Инактивировали ферменты добавлением ЭДТА до конечной концентрации 10 mM. Очистку ДНК вектора проводили с помощью выделения из геля (легкоплавкая агароза) по методике, описанной выше.

2.2.4 Подготовка фрагментов ДНК

Фрагмент ДНК, содержащий ген Т4 ДНК-полимеразы, полученный с помощью ПЦР, обрабатывали рестриктазами XhoI и BspIS4I [15], сайты для которых были заложены в синтезированных олигонуклеотидах. Сначала проводили рестрикцию с XhoI (при 37o C), т.к. эта рестриктаза инактивируется прогреванием при 65o C 20 минут. Для рестриктазы XhoI есть сайт в олигонуклеотиде 2F2 (к 3'-области гена) и внутри последовательности гена Т4 ДНК полимеразы , по этому делали полный гидролиз. В результате было получено два фрагмента : 2500 (3'-конец гена 43) и 196 пар оснований (5'-конец гена 43). После инактивации XhoI в ту же смесь добавили рестриктазу BspIS4I, для которой был заложен сайт в праймере к 5'-области гена. Инкубировали 30 мин при 48o C, инактивировали фермент добавлением ЭДТА (до конечной концентрации 10mM). Экстрагировали фенолом и смесью фенол:хлороформ (1:1) [46].

Перед экстрацкией к образцу добавляли раствор т-РНК (в качестве соосадителя) до конечной концентрации 20мкг/мл. ДНК осадили этанолом и растворили в 50 мкл ТЕ. Таким образом в растворе присутствовали фрагменты гена Т4 ДНК-полимеразы длиной 2500 и 196 п. о.

Фрагменты ДНК, содержащие гены РНК-лигазы и Tth-полимеразы обрабатывались эндонуклеазой Bli736I, сайты для которой находятся в праймерах к 5/-концу гена, и XhoI, EcoRI (сайты для которых заложены в праймерах к 3/-концу генов), соответственно. Фрагмент, содержащий ген полинуклеотидкиназы, обрабатывался эндонуклеазами PaqI (5/-конец) и XhoI.

2.2.5 Лигирование

Реакционная смесь (для случая с Т4 ДНК-полимеразой): ДНК-вставка 10 мкл (400 нг), ДНК-вектор 20 мкл (200 нг), 10х лигазный буфер 4 мкл, АТФ 10 mM- 4 мкл, ДТТ 200mM 1 мкл, Т4 ДНК-лигаза 1 мкл. Инкубация 16 часов при комнатной температуре.

В качестве контроля проводили лигазную реакцию с плазмидной ДНК (pMTL: XbaI ) без вставки. Инактивировали ДНК-лигазу прогревом при 65o 15 мин. Эффективность лигирования оценивали по электрофорезу (переход линейной формы плазмидной ДНК в кольцевую).

Лигирование молекул вектора и фрагмента (с геном полинуклеотидкиназы фага Т4) проводилось в 20 мкл реакционной смеси, содержащей: 2 мкл lig- буфера, 2 мкл 10 мМ АТФ, 2мкл 50мМ ДТТ, 6 мкл (190 нг) pET-28b:NcoI:XhoI , 8 мкл (40нг) ДНК-вставки, 1 мкл ДНК-лигазы фага Т4. Пробу инкубировали в течение 4 часов при комнатной температуре. Затем лигазу инактивировали прогреванием 20 мин при 75o С.

2.2.6 Трансформация клеток E. Сoli

Трансформацию проводили кальциевым методом и методом электропорации.

Подготовка компетентных клеток для электротрансформации. Петлей с косяка засевали "ночную культуру" E.coli BL21(DE3)pLysS в пробирку с 5 мл LB-среды и инкубировали ночь на качалке при 37oС. В колбу со 100 мл LB-среды вносили 1 мл ночной культуры и растили при 37o с хорошей аэрацией до плотности 0.5-1 ОЕ при 590 нм. Клетки осаждали центрифугированием при 4000 об/мин 15 мин в предварительно охлажденных стаканах. Следующие операции проводили в ледяной бане. Осажденные клетки дважды промывали холодным раствором для промывки клеток (1 mM HEPES pH 7.0) и два раза 10%-ным глицерином. Ресуспендировали клетки в 200-300 мкл 10%-ного глицерина. Полученные компетентные клетки хранили при -70oС, расфасованными аликвотами по 70 мкл.

Электротрансформация. Электрокомпетентные клетки размораживали при комнатной температуре и помещали на лед. К суспензии клеток добавляли 1 мкл раствора ДНК (из лигазной реакции) , смесь выдерживали во льду более 1 мин. В предварительно охлажденные ячейки помещали 70 мкл суспензии и обрабатывали одиночным высоковольтным импульсом (1700 В). Сразу после обработки в ячейку добавляли 1 мл SOC-среды, клетки переносили в пробирки и инкубировали 1 час при 37oС для экспрессии генов антибиотик резистентности. После этого производили высев на чашки с LB-агаром, содержащим соответствующие антибиотиками. Клетки инкубировали ночь при 37oС.

Приготовление клеток кальциевым методом и трансформация

Подращивали культуру клеток до оптической плотности 0,3. Поместили клетки в большие пробирки "Эппендорф", центрифугировали 2 мин при 3000 об/мин. LB-среду слили, добавили 500 мкл 100 mM CaCl2. Центрифугировали в течение 2 мин при 3000 об/мин. К осадку добавили 100 мкл буфера К, клетки ресуспендировали, оставили на 30 мин при 0oС. Затем добавили ДНК ( 30 нг вектора из лигазной реакции). Оставили еще на 30 мин при 0oС, после чего перенесли клетки на 2 мин в баню на 42oС . Затем образцы опять перенесли в ледяную баню, инкубировали 5-7 мин. Добавили 500 мкл LB-среды, инкубировали 1 час при 37o С и хорошей аэрации.

На чашки с LB агаром, содержащим соответствующий антибиотик, высевали 300 мкл клеток. Инкубировали ночь при 37oС.

2.2.7 Анализ клонов

Анализ клонов проводили рестрикцией плазмидной ДНК или с помощью метода ПЦР с колоний.

Мини-препаративное получение плазмидной ДНК.

Клетки, содержащие плазмидную ДНК, выращивали в 2 мл LB-среды до поздней логарифмической фазы роста. Клетки центрифугировали 1 мин при 12000 об/мин в центрифуге Eppendorf (Eppendorf, США). Клетки ресуспендировали в 100 мкл раствора 1 () содержащем РНКазуI (10 мкг/мл) и лизоцим (7мг/мл), инкубировали 15 мин при комнатной температуре. Добавили 200 мкл раствора 2 (0,2 н NaOH, 1% SDS). Инкубировали 15 мин. Пробирки переносили в лед и добавляли 150 мкл 3 М ацетат Na. Оставили на льду на 15 мин, затем центрифугировали при 12000 об/мин. Супернатант переносили в пробирку и переосаждали этанолом. ДНК промывали 70% этанолом, сушили и растворяли в буфере ТЕ.

ПЦР с колоний.

Отдельные колонии ресуспендируются в 30 мкл ТЕ-буфера, образцы кипятятся 5 минут и центрифугируются 3 мин при 3000 об/мин. В супернатанте находится плазмидная ДНК. В отдельные пробы с15 мкл реакционной смеси для ПЦР добавляется по 5 мкл раствора плазмидной ДНК. Проводится ПЦР с использованием одного универсального праймера, комплементарного, например, Т7 терминатору вектора pET-21d (или pET-28b), и праймера, комплементарного 5/-концу фрагмента. Такой подход используется для избежания фальшивого позитивного результата при выполнении данной процедуры и заодно сразу подтверждается правильная ориентация фрагмента в векторе [47].

2.2.8 Клонирование ДНК-полимеразы фага Т4

Клонирование гена Т4 ДНК-полимеразы проводили в два этапа, так как сайт для эндонуклеазы XhoI находится внутри последовательности гена и в праймере к 3/-концу гена. Клонирование 5/-концевого фрагмента описано выше.

Анализ клонов проводился обработкой плазмидной ДНК рестриктазами XhoI и SphI. Отщепленный фрагмент свидетельствовал о присутствии клонированного N-конца гена Т4 ДНК-полимеразы (рис 5) в плазмидах четырех клонов.

Клонирование 3'-концевого фрагмента гена 43. Расщепляли полученную плазмиду, содержащую 5'-концевую последовательность гена рестриктазой XhoI. Проводили лигирование со вставкой аналогично предыдущей реакции лигирования.

Трансформировали клетки BL21(DE3), приготовленные кальциевым методом[13].

Анализ клонов проводили обработкой плазмидной ДНК рестриктазой XhoI. В качестве контроля служила ДНК рЕТ21-d с клонированным 5'-концом гена 43 (плазмида pET43N). Было отобрано 2 клона (2 и 9), в которых видна была вставка большого фрагмента. Для определения ориентации большего фрагмента гена 43 (3'-конца) производили гидролиз рестриктазами NsiI и BspLu11II (изошизомер эндонуклеазы XbaI). О результате расщепления судили по электрофорезу в 1%-ном агарозном геле. Полоса, соответствующая 2072 парам оснований, свидетельствовала о правильной ориентации лигированного фрагмента в обоих клонах (рис. 5).

2.2.9 Индукция экспрессии генов

Штрихом засеяли поверхность агара, клетки инкубировали 12 часов при 37o С. Затем засеяли культуру в 50 мл LB-среды и выращивали до плотности 0,5 ОЕ при 590 нм. Отобрали по 5 мл исходной культуры и к основной массе добавили индуктор - ИПТГ (водный раствор) до конечной концентрации 40мкг/мл. После этого клетки оставили расти при 37oС. Через 3 часа отобрали по 5 мл индуцированной культуры. По 1 мл всех образцов (исходные и индуцированные) центрифугировали 10 мин при 12000 об/мин. Супернатант убрали, образцы заморозили при -200С. К размороженному осадку добавляли лизирующий буфер, объем которого рассчитывался по пропорции:

плотности 0,32 - соответствует 50мкл буфера

измеренной плотности - соответствует Х мкл буфера

Гомогенизировали клетки в соответствующем количестве лизирующего буфера, образцы кипятили в течение 4 минут, после чего наносили на электрофорез (по 10 мкл каждого образца). Электрофорез проводили в 10% полиакриламидном геле, буфер "Laemmly". После окончания электрофореза окрашивали гель красителем Кумасси. Затем несколько раз отмывали гель при 100oС. Индукция экспрессии генов ДНК-полимеразы, полинуклеотидкиназы, РНК-лигазы фага Т4 и Tth-полимеразы представлена на рисунках 6, 7, 9, 10, соответственно.

2.2.10 Распределение белка по растворенной и нерастворенной фракциям

50 мл индуцированных клеток центрифугировали на центрифуге Janetzki K23 5 мин при 5000 об/мин. Убрали супернатант и ресуспендировали клетки в 1/10 начального объема (в 5 мл) буфера (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2 mM ЭДТА). Добавили лизоцим до конечной концентрации 100 мкг/мл (использовали свежеприготовленный раствор лизоцима 10 мг/мл). Затем добавили 1/10 объема (0.5 мл) 1% Triton X-100. Инкубировали 15 мин при 30o С. Поместили образцы в ледяную баню и обработали ультразвуком для разрушения ДНК. Раствор потерял вязкость после обработки ультразвуком два раза по 30 секунд с интервалом 2 мин. Центрифугировали при 12000 об/мин в течение 15 мин при 40oС. Супернатант содержал растворенную фракцию. Часть супернатанта, предназаначенную для электрофоретического анализа, развели в два раза двухкратным лизирующим буфером. Осадок ресуспендировали в 5 мл однократного лизирующего буфера для электрофореза. Нанесли на электрофорез (в 10%-ный ПААГ) по 10 мкл каждого образца [14]. Результат представлен на рисунке. 11. Т4 ДНК-полимераза и полинуклеотидкиназа находились в растворенной фракции (рис. 6, 7, соответственно).

2.2.11 Выделение Т4 ДНК-полимеразы

Культуру колеток E. coli с рекомбинантной плазмидой (содержащей ген 43 фага Т4) выращивали в 4-ех колбах по 350 мл среды LB при 37o С с постоянной аэрацией до плотности А590=0,7 О.Е.. Проводили индукцию экспресии гена ДНК-полимеразы фага Т4 добавлением водного раствора ИПТГ (до концентрации 40 мкг/мл). Клетки выращивали еще 3 часа в тех же условиях. Плотность индуцированной культуры составила А590=1.1 О.Е. Клетки осаждали центрифугированием. Масса осадка составила 4г. Для разрушения клеточной биомассы осадок ресуспендировали в 80 мл буфера (50 мМ Трис-НСl, pH 8,0., 2мМЭДТА). Добавили лизоцим до концентрации 100 мкг/мл (8 мг на 80 мл) и 1/100 объема суспензии 10% ТритонаХ-100 (800мкл). Инкубировали 15 мин при 30o С . Клетки разрушали в ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-А при 10o С (30 с- "озвучивание", 2 мин - пауза, 3 раза) до уменьшения оптической плотности при длине волны 590 нм в 7 раз. Раствор центрифугировали 40 мин при 16000 об/мин. Экстракт развели в 2 раза 2-х кратным Binding-буфером (10мМ имидазол, 1М NaCl, 40мМ Трис-HCl, pH 7,9), фильтровали через стеклянный фильтр и наносили на колонку с Ni2+-NTA-агарозой. Скорость протекания буфера через колонку 60 мл/час, объем образца 120 мл. Колонку промывали 10 объемами (100 мл) Binding-буфера (5мМ имидазол, 0,5 М NaCl, 20 mMТрис-HCl, pH 7,9), затем 6 объемами (60 мл) Wash- буфера (60мМ имидазол, 0,5М NaCl, 20 mM Трис-HCl, pH 7,9) и 4 объемами (40 мл) Elute-буфера (1M имидазол, 0,5 M NaCl, 20 мМ Трис-HCl, pH 7,9).

2.2.12 Выделение полинуклеотидкиназы фага Т4

Культуру клеток E. coli BL21(DE3) выращивали в жидкой среде LB при 37o C с постоянной аэрацией до плотности А590=0,68. Добавляли ИПТГ (40мг/мл) до конечной концентрации 40 мкг/мл.

Клетки выращивали еще 7 часов при тех же условиях и затем осаждали центрифугированием 6000 об/мин 30 мин. Осадок ресуспендировали в 100 мл ТЕ-буфера (10мМ Трис-HCl, pH 8,0, 1mM ЭДТА) , центрифугировали 10 мин при 6000 об/ мин. Полученную биомассу хранили при -200С.

Для разрушения клеток 6г биомассы (полученной из 2 литров культуры) ресуспендировали в 80 мл Binding-буфера (5мМ имидазол, 0,5М NaCl, 20 мМ Трис-HCl, pH 7,9 ). Далее клетки разрушали в ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-А (40 сек "озвучивание", 2 мин. перерыв) в ледяной бане до уменьшения оптической плотности при длине волны 590 нм в десять раз. Суспензию разрушенных клеток цен.трифугировали 40 мин при 16000 об/мин. Супернатант пропустили через крупнопористый стеклянный фильтр (для устранения грубых загрязнений), нанесли на колонку с Ni2+-NTA-агарозой, промытую водой (3 объема колонки), 50mM NiSO4 (5 объемов), Binding-буфером (3 объема). После нанесения образца колонку промыли 10 объемами Binding-буфера, а затем 6 объемами Wash-буфера (60мМ имидазол, 0,5 М NaCl, 20мМ Трис-HCl, pH 7,9) и 6 объемами Elute-буфера (1М имидазол, 0,5 М NaCl, 20мМ Трис-HCl, pH 7,9). Фракции, содержащие фермент, объединили, измерили концентрацию полинуклеотидкиназы (по поглощению при длине волны 280 нм). Рассчет коэффициента экстинции проводили по формуле ?280= (NTrp*5,500 + NTyr*1,490 + NCys*0,125)/Mr, согласно [48]. В рассчет брались только Cys свободные, не участвующие в образовании дисульфидных связей.

2.2.13 Выделение РНК-лигазы фага Т4

Выделение РНК-лигазы фага Т4 проводили в две стадии.

1. Выделение фермента на Ni-NTA-агарозе, проводили так же, как и в случае выделения полинуклеотидкиназы. Не удалось очистить фермент от других белков (рис. ), по этому было принято решение провести еще одну стадию выделения.
2. Фракции, содержащие Т4 РНК-лигазу, объединили и нанесли на колонку с голубой агарозой объемом 10 мл, уравновешенную буфером Е(50 мМ Трис HCl, pH 7,5., 10 мМ MgCl2, 1 мМ ДТТ). Элюцию проводили 100 мл градиента 0-2М KCl в буфере Е со скоростью 20 мл/час (рис. ). Фракции, содержащие Т4 РНК-лигазу, объединили и диализовали против буфера для хранения (10 мМ Трис HCl, pH 7,5., 50 мМ KCl, 0,1 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ, 50% глицерин). Препарат хранили при -20o С. Количество выделенного фермента составило 5,2 мг.

2.2.14 Выделение Tth ДНК-полимеразы

Выделение Tth-полимеразы проводилось согласно методике выделения Taq-полимеразы [9].

Культуру клеток E. coli BL21(DE3) с рекомбинантной плазмидой, несущей ген Tth ДНК-полимеразы, выращивали в жидкой среде LB при 37o C с постоянной аэрацией до плотности А590=0,57. Добавляли ИПТГ до конечной концентрации 40 мкг/мл. Клетки выращивали еще 7 часов при тех же условиях и затем осаждали центрифугированием 6000 об/мин 30 мин. Осадок ресуспендировали в 100 мл ТЕ-буфера (10мМ Трис-HCl, pH 8,0, 1mM ЭДТА) , центрифугировали 10 мин при 6000 об/ мин. Полученную биомассу хранили при -20o С.

Для разрушения клеток 3г клеточной биомассы ресуспендировали в 30 мл буфера для выделения (50 мМ Трис НCl рН 7,5, 1мМ ЭДТА, 1,25 мМ PMSF, 2 мг/мл лизоцима). После инкубации в течение 15 минут при 20o С клетки разрушали в ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-А (2 мин. "озвучивание", 1 мин. перерыв) в ледяной бане до уменьшения оптической плотности при длине волны 590 нм в десять раз. Для денатурации белков с нуклеиновых кислот к лизату при постоянном помешивании и 4o С добавляли по каплям сульфат аммония до концентрации 0,2М.

Суспензию разрушенных клеток центрифугировали 30 мин при 20000 об/мин на центрифуге Beckman LS-75 (ротор T35, Beckman, США). Для денатурации белков E. coli супернатант прогревали при 75o С в течение 30 минут. Затем к раствору при постоянном помешивании добавили полиимин Р до концентрации 0,6% при 4o С. Раствор инкубировали 2 часа на льду, а затем центрифугировали 30 мин при 20000 об/мин. Супернатант был нанесен на колонку с фенил-сефарозой объемом 6 мл, уравновешенную буфером А(50 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 1 мМ ЭДТА), содержащим 0,2 М сульфат аммония. Промыли колонку буфером А, содержащим 20% глицерин (wt/vol). Элюцию связавшихся белков проводили 100 мл линейного градиента концентрации мочевины (0-4М) на буфере А со скоростью 10мл/час. Собирали фракции по 5 мл. Оптический профиль элюции определяли по поглощению при 280 нм в проточном спектрофотометре UV-1 ("Pharmacia", Швеция). Фракции, содержащие Tth-полимеразу, объединяли и диализовали в течение ночи против буфера Б (100мМ KCl, 50мМ Трис-HCl, pH 7,5, 0,1мМ ЭДТА, 0,2% Tween20). Диализованный препарат наносили на колонку с гепарин-сефарозой, уравновешенную буфером Б. Элюцию вели 60 мл градиента 100-700 мМ KCl в буфере Б со скоростью 10 мл/час. Фракции собирали по 3 мл. Фракции, содержащие Tth-полимеразу, объединили и диализовали против буфера для хранения (20 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 100мМ KCl, 0,1мМ ЭДТА, 1мМ дитиотрейтол, 0,2% Tween20, 50% глицерин). Диализованный препарат хранили при -20o С.

2.2.15 Определение активности ДНК-полимеразы фага Т4

Определение активности фермента проводили согласно методике, предложенной Корнбергом [49].

Определение единицы активности: Одна единица фермента катализирует включение 10 нмоль всех дезоксинуклеотидов в кислотонерастворимую форму за 30 мин при 37o С. Удельная активность ДНК-полимеразы выражается в единицах на миллиграмм фермента.

Реакционная смесь содержала: 67мМ Трис-HCl, pH 8,8., 6,7 мM MgCl2, 1мМ ДТТ, 16,7 мМ (NH4)2SO4, 0,2 мг/мл БСА, 0,033мМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата (dNTP), 10 ?Сi [? -P32] dTTP или dATP денатурированную ДНК спермы лосося или активированную ДНК тимуса теленка.

Буфер для разведения фермента: 67мМ Трис-HCl, pH 8,8., 6,7 мM MgCl2, 1мМ ДТТ, 16,7 мМ (NH4)2SO4, 0,2 мг/мл БСА.

В пробы для измерения активности (объем 50 мкл) вносится 1мкл фермента из различных разведений. В качестве контроля берется проба без добавления фермента (фоновое включение dNTP в отсутствии ДНК-полимеразы). Инкубация 30 мин при 37o С. Далее следует 2 варианта:

Вариант 1: Пробы наносятся на ДЕАЕ-бумагу, которая затем промывается 3 раза в 0,5 М Na2HPO4 (pH 7,0) [50]. Бумагу можно оставить влажной до измерения количества импульсов.

Вариант 2: Образцы наносятся на фильтр GFC (Whatman). Фильтры высушиваются и промываются 3 раза по 2 мин в 200 мл раствора 200 мМ Na4P2O7, 5% ТХУ(охлажденной на льду), после чего промываются 70% этанолом и высушиваются [50].

Измеряется радиоактивный фон среды (количество импульсов), затем измеряется количество импульсов, которое дает каждая проба. В качестве контроля - проба не инкубированная и не содержащая фермент (измеряется количество импульсов, которое дает сама метка). Вычисляется процент включения dNTP от суммарной метки в реакции. Отсюда можно выяснить количество dNTP, включившихся за время инкубации (нам известно количество dNTP в реакционной смеси) и активность полимеразы.

3. Результаты и их обсуждение

3.1 Клонирование гена полинуклеотидкиназы фага Т4

Клонирование гена полинуклеотидкиназы фага Т4 в вектор для экспрессии pET28-b проводили по общепринятой схеме. Полученный ПЦР-продукт обрабатывался эндонуклеазами Paq I и Xho I. Paq I (изошизомер BspH I) узнает сайт 5/-TCATGA-3/, внутри которого содержится АTG-кодон. Второй кодон гена начинается с аденина и в последовательности гена отсутствуют сайты для Paq I. Таким образом, удалось без каких-либо сложностей клонировать ген pseT в удобном положении относительно последовательности Шайн-Дальгарно. Индукция экспрессии гена Т4 полинуклеотидкиназы представлена на рисунке 7.

3.2 Клонирование генов ДНК-полимеразы, РНК-лигазы фага Т4 и Tth-полимеразы

Клонирование генов ДНК-полимеразы, РНК-лигазы фага Т4 и Tth-полимеразы проводили с использованием эндонуклеаз рестрикции II-S типа.

Для достижения того же результата, что и в случае гена pseT (клонирование под ATG-кодон вектора pET21-d) по идее можно использовать еще 3 эндонуклеазы: Nco I, Nde I и BspLu11 I, в сайтах узнавания которых тоже содержится старт-кодон. Но в этом случае мы столкнулись с несколькими проблемами:

) В последовательности генов встречался сайт для рестриктазы (Nco I в последовательности гена Tth-полимеразы, Nde I в последовательности гена Т4 ДНК-полимеразы).

) Налагалось условие на второй кодон, если использовать Nco I для клонирования генов ДНК-полимеразы и РНК-лигазы фага Т4, или Paq I для клонирования Tth-полимеразы. Изменение аминокислоты на N-конце белка может приводить к более быстрой его деградации . Данные относительно этой проблемы приводятся в работах Варшавского, который сформулировал правило N-конца (N-rule) [51].

) Эндонуклеаза Nde I плохо гидролизует ДНК на концах фрагментов (0% расщепления , если сайт находится в пределах 18 п.о. с конца молекулы) [52].

Решением этих проблем явилось использование уникального свойства эндонуклеаз II-S типа, заключающееся в том, что эти рестриктазы узнают точный сайт, но расщепляют ДНК в стороне нескольких нуклеотидов от него. Например, использованная нами для клонирования гена Т4 ДНК-полимеразы эндонуклеаза BspIS4 I узнает сайт 5/-GAAGAC-3/, а расщепляет ДНК на расстоянии 2/6 нуклеотидов от него [53] (рис. 8).

Т.к. лучше клонировать ген под старт-кодон вектора, то мы заложили в праймере к 5/-концу клонируемого гена сайт для эндонуклеазы BspIS4I таким образом, чтобы в результате расщепления образовывался такой же липкий конец, что и после действия NcoI (для последующего лигирования с вектором, расщепленным по NcoI-сайту), что показано на рисунке 8.

Возможность использования этого метода была подтверждена на примере клонирования гена РНК-лигазы фага Т4 и гена Tth-ДНК полимеразы из Thermus thermophilus HB8 с использованием другой II-S рестриктазы- Bli736I. На рисунке 8 изображен сайт узнавания для этой эндонуклеазы и структура праймеров, использованных для амплификации соответствующих фрагментов ДНК.

Индукция экспрессии генов ДНК-полимеразы, РНК-лигазы фага Т4 и Tth-полимеразы показана на рисунках 6, 9, 10 соответственно.

3.3 Выделение ДНК-полимеразы и полинуклеотидкиназы фага Т4

Гены этих ферментов были клонированы в pET-вектор таким образом, что на С-конец синтезируемых в последствии белков "навешивался хвост" из 6-ти гистидинов (так называемый His-taq). Такой гистидиновый "хвост" позволяет проводить - афинную хроматографию на Ni2+ -NTA-агарозе. Таким образом белки можно очистить за одну стадию [54]. Осветленный лизат бактериальной массы наносили на колонку с Ni2+-NTA-агарозой. После этого проводили промывку Wash и Elute буферами (концентрация имидазола 60мМ и 1М, соответственно). Т4 ДНК-полимераза элюировалась в Wash-буфере (рис.11), а полинуклеотидкиназа - как в Wash, так и в Elute-буфере (рис. 12). Таким образом было получено 30 мг Т4 ДНК-полимеразы и около 80 мг Т4 полинуклеотидкиназы.

3.4 Определение активности ДНК-полимеразы фага Т4

Определение единицы активности ДНК-полимеразы: Одна единица фермента катализирует включение 10 нмоль всех дезоксинуклеотидов в кислотонерастворимую форму за 30 мин при 37o С. Удельная активность выражается в единицах активности на миллиграмм фермента.

Реакцию проводили в присутствии меченного [?-32P]АТФ. Активность фермента определяли по эффективности включения меченного дезоксинуклеотида. Были получены различные данные, в зависимости от ДНК, используемой в качестве субстрата. Наибольшее значение активности было получено при использовании в качестве субстрата денатурированной ДНК спермы лосося ( 300000 ед/мг). Более низкое значение получено при использовании кольцевой молекулы М13 с универсальным праймером в качестве затравки ( 151345 ед/мг).

3.5 Выделение РНК-лигазы фага Т4

Очистку РНК-лигазы проводили в две стадии:

1. Выделение на колонке с Ni2+-NTA-агарозой проводили аналогично вышеописанному случаю. Элюировали белки градиентом концентрации имидазола ( 5мМ- 1М). Но в этом случае не удалось избежать примесей других белков, в связи с чем пришлось проводить дополнительную стадию очистки. Результат хроматографии представлен на рис.13.
2. Очистка на колонке с голубой агарозой (рис. 13). Этот носитель служит для выделения АТФ-связывающих белков, одним из которых является РНК-лигаза. Элюирование проводили градиентом концентрации 0-2 M KCl. Фермент элюировался в диапазоне концентраций KCl от 200 до 800 мМ.

В итоге получили 5,2 мг фермента с одного грамма клеточной биомассы.

3.6 Выделение Tth ДНК-полимеразы

Выделение Tth-полимеразы проводили согласно методике очистки Taq-полимеразы [9], предполагая, что ферменты при очистке должны вести себя сходным образом, т.к. имеют много общих свойств (высокий процент гомологии).

Очистка Tth-полимеразы включала две стадии (рис. 14):

1. Хроматография на колонке с фенил-сефарозой. Фермент элюировался в диапазоне концентраций мочевины от 1 до 2,8 М. Фракции, содержащие полимеразу, объединили для следующей стадии очистки (рис. 15).
2. Хроматография на колонке с гепарин-сефарозой (рис. 15). Фермент с колонки элюировался в диапазоне концентраций от 166 до 266 мМ КCl.

Всего было получено 2,4 мг фермента с 3 граммов клеточной биомассы (из 2л культуры).

3.7 Активности РНК-лигазы и полинуклеотидкиназы фага Т4

Из литературных источников найдены значения удельных активностей для РНК-лигазы (2180 единиц/мг белка) и полинуклеотидкиназы (62000 единицы/ мг белуа). Зная количество выделенных ферментов мы предполагаем, что суммарная активность РНК-лигазы равна 11336 единицам, а активность полинуклеотидкиназы равна 4960000 единиц.

Выводы

1. Разработан новый универсальный метод клонирования фрагментов ДНК с использованием II-S типа эндонуклеаз рестрикции.
2. Получены суперпродуценты ДНК-полимеразы, полинуклеотидкиназы, РНК-лигазы фага Т4 и Tth ДНК-полимеразы из штамма T. thermophilus HB8.
3. Выделены две ДНК-полимеразы: фага Т4 и T. thermophilus HB8. Оба фермента очищены до функционально чистого состояния. Выход Т4 ДНК-полимеразы составил 7,5 мг с одного грамма клеточной биомассы. Получено 2,4 мг Tth ДНК-полимеразы. Выход белка составил 0,8 мг с грамма биомассы.
4. Активность ДНК-полимеразы фага Т4 составляет примерно единиц на мг белка.
5. Выделено 5,2 мг РНК-лигазы фага Т4. Выход белка составил 0,4 мг с грамма клеточной биомассы.
6. Выделена полинуклеотидкиназа фага Т4. Выход белка составил 13 мг с грамма клеточной биомассы.
7. Ожидаемая суммарная активность Т4 РНК-лигазы 11336 единиц , Т4 полинуклеотидкиназы - 4960000 единиц активности.

Cписок использованной литературы

1) Корнберг А. // Синтез ДНК - 1977.

2) Kenneth J.M. // Enzymology of DNA in replication in procaryotes - Reprinted from the CRC Critical reviews in biochemistry, 1984, V. 17, Issue2, p.153.

) Lin T.C., Rush J, SpacerE.K, Konigsberg W. H // Cloning and expression of T4 DNA polymerase - Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 1987, v. 84, p.7000.

) Молекулярная биология: структура и биосинтез нуклеиновых кислот - под ред. Спирина А.С., 1990.

) Стент Г., Келиндар Р. // Молекулярная генетика - 1981.

) Kong, Kurcea K.B, Jack W.E. // Characterization of a DNA polymerase from the hyperthermophile Archaea Thermococcus litoralis - JBC, 1993, v. 268, p. 1965.

7) Tabor S, Huber H.E, Richardson C.C // Escherihia coli Thioredoxin confers processivity on the DNA polymerase activity of the Gene 5 protein of bacteriophage T7 - JBC, 1987, v.262, p. 33.

) Longley M.J., Bennet S.E., Mosbaugh D.W. // Characterization of the 5/ to 3/ exonuclease associated with Thermus aquaticus DNA polymerase - Nucl. Acids Res., 1990, v. 18, No. 24, p. 7317-7322.

) Lawyer F.C., Stoffel S., Saiki R.K., Chang S.Y., Landre P.A., Abramson R.D., Gelfand D.H. //High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5/ to 3/ exonuclease activity - Cold spring harbor laboratory press, 1993, v. 2, p. 275-287.

) Lu C., Erickson H.P. // Expression in Escherichia coli of the thermostable DNA polymerase from Pyrococcus furiosus. - Protein expression and purification, 1997, v. 11, p. 179-184.

) Pfu DNA polymerase. // Instruction manual, Stratagene, 1998.

) AmpliTaq DNA Polymerase, Stoffel Fragment.

) Myers, T.W., Gelfand D.H. // Reverse transcription and DNA amplification by a Thermus thermophilus DNA polymerase. - Biochemistry, 1991, v. 30, No. 31, p. 7661.

14) Глухов А.И., Трофимова М.Е., Гордеев С.А., Гребенникова Т.В., Виноградов С.В., Киселев В.И., Крамаров В.М. // Амплификация последовательностей ДНК фага ? методом полимеразной цепной реакции с использованием термостабильной ДНК-полимеразы. - Молекулярная биология, 1991, том 25, вып. 6, с.1602-1609.

) Гребенникова Т.В., Глухов А.И., Чистякова Л.Г., Киселев В.И., Северин Е.С. //Использование термостабильной ДНК-полимеразы из Thermus thermophilus КТП в совмещенной реакции обратной транскрипции и амплификации для детекции РНК интерлейкина 2? и определение экспрессии гена множественной лекарственной устойчивости (MDR-1). - Молекулярная биология, 1995, том 29, вып. 4, с. 930-941.

) Смирнов Ю.В., Чахмахчева О.Г., Ефимов В.А. // Рекомбинантная His6-ДНК-полимераза Thermus thermophilus с активностью обратной транскриптазы.- Биоорганическая химия, 1997, том 23, N 4, с. 257-261.

1. Игнатов К.Б, Крамаров В.М., Чистякова Л.Г., Мирошников А.И.// Факторы, определяющие различную процессивность ДНК-полимераз Thermus thermophilus и Thermus aquaticus при амплификации ДНК фага ?. - Молекулярная биология, 1997, том 31, N 6, с. 956-961.
2. Midgley, C.A., Murray, N.E.// T4 polynucleotide kinase; cloning of the gene (pseT) and amplification of its product. - The EMBO Journal, 1985, v.4, p. 2695-2703.
3. Richardson, C.C. // Phosphorilation of nucleic acid by an anzyme from T4 bacteriophage-infected Escherichia coli. - Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1965, v. 54, p. 158.
4. Soltis, D.A., Uhlenbeck, O.C. // Independent locations of kinase and 3/-phosphatase activities on T4 polynucleotide kinase. - J. Biol. Chem., 1982, v. 257, p. 11340-11345.
5. Lillehaug, J.R.// Physicochemical properties of T4 polynucleotide kinase. - Eur. J. Biochem., 1977, v. 73, p. 499-506.
6. Cameron, V., Uhlenbeck, O.C. // 3/-phosphatase activity in T4 polynucleotide kinase. - Biochemistry, 1977, v. 16, p. 5120.
7. Van de Sande, J.H., Kleppe, K., Khorana, H.J. //Reversal of bacteriophage T4 induced polinucleotide kinase action. - Biochemistry,1973, v. 12, p. 5050.
8. Teraoka, H., Mizuta, K., Sato, F., Shimoyachi, M., Tsukada, K. // Polynucleotide kinase from rat-liver nuclei - Eur. J. Biochem., 1975, v. 58, p. 297-302.
9. Levin, C.J., Zimmerman, S.B. // A deoxyribonucleic acid kinase from nuclei of rat liver. - J. Biol. Chem., 1976, v. 251, no. 6, p. 1767-1774.
10. Harrison, B., Zimmerman, S.B. // T4 polynucleotide kinase: macromolecular crowding increases the efficiency of reaction at DNA termini. - Analytical biochemistry, 1986, v. 158, p. 307-315.
11. Chaconas, G., Van de Sande, J.H., Church, R.B. // End group labelling of RNA and double stranded DNA by phosphate exchange catalyzed by bacteriophage T4 induced polynucleotide kinase. - Biochem. Biophys. Res. Commun., 1975, v. 66, p.962-969.
12. Berkner, K.L., Folk, W.R. // Polynucleotide kinase exchange reaction (Quantitative assay for restriction endonuclease-generated 5/-phosphoryl termini in DNAs). - J. Biol. Chem., 1977, v. 252, p. 3176-3184.
13. Kroeker, W.D., Laskowski, M. // Polynucleotide kinase: functional purification and use in the direct kinetic measurement of single- and double-strand cleavages of DNA by restriction and other endonucleases of limited action. - Analytical biochemistry, 1977, v. 79, pp. 63-72.
14. Silber, R., Malathi, V,G., Hurwitz, //J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1972, v. 69, p. 3009-3013.
15. The Enzymes, 1982, v.XV. T4 RNA ligase.
16. Lubben, T.H., Gumport, R.I. //The purification of nuclease-free T4-RNA ligase - Biochimica et Biophisica Acta, 1979, v. 562, p. 149-161.
17. Uhlenbeck, O.C. // T4 RNA ligase - TIBS- March 1983.
18. Rand, K.N., Gait, M.J. // Sequence and cloning of bacteriophage T4 gene 63 encoding RNA ligase and tail fibre attachment activities - The EMBO Journal, 1984, v.3, p. 397-402.
19. Sugino, A., Snopek, T.J., Cozzarelli, N.R. //Bacteriophage T4 RNA ligase. - J. Biol. Chem.,1977, v. 252, p. 1732-1738.
20. Sninsky, J.J., Last, J.A., Gilham, P.T. // The use of terminal blocking groups for the specific joining of oligonucleotids in RNA ligase reactions containing equimolar concentrations of acceptor and donor molecules. - Nucl. Acids Res., 1976, v. 3, p 3157-3166.
21. Ohtsuka, E., Nishikawa, S., Sugiura, M., Ikehara, M. //Joining of ribooligonucleotides with T4 RNA ligase and identification of the oligonucleotide-adenilate intermediate. - Nucl. Acids Res.,1976, v. 3, p 1613-1623.
22. Uhlenbeck, O.C., Cameron, V. //Equimolar addition of oligoribonucleotides witn T4 RNA ligase. - Nucl. Acids Res., 1977, v. 4, p 85-98.
23. Moseman McCoy, M.I., Gumport, R.I. // T4 ribonucleic acid ligase joins single-strand oligo(deoxiribonucleotides). - Biochemistry, 1980, v. 19, p. 635-642.
24. Krug, M., Uhlenbeck, O.C. // Reversal of T4 RNA ligase - Biochemistry, 1982, v. 21, p. 1858-1864.
25. Runnels, J.M., Soltis, D., Hey, T., Snyder, L. // Genetic and phisiological studies of the role of the RNA ligase of bacteriophage T4. - J. Mol. Biol., 1982, v. 154, p. 273-286.
26. Ohtsuka, E., Nishikawa, S., Fukumoto, R., Tanaka, S., Markham, A. F., Ikehara, M., Sugiura, M. //Joining of syntetic ribonucleotides with defined sequences catalyzed by T4 RNA ligase. - Eur. J. Biochem, 1977, v. 81, p.285-291.
27. Snopek, T.J., Sugino, A., Agarwal, K.L., Cozzarelli, N.R. /./Catalysis of DNA joining by bacteriophage T4 RNA ligase. - Biochem. Biophys. Res. Commun., 1976, v. 68, p. 417-424.
28. England, T.E., Uhlenbeck, O.C. // 3/-terminal labelling of RNA witn T4 RNA ligase. - Nature, 1978, v. 275, p 560-561.
29. Zhang, X.H., Chiang, V.L. // Single-stranded DNA ligation by RNA ligase for PCR cloning of 5/-noncoding fragments and coding sequence of a specific gene. - Nucleic Acids Res., 1996, Mar 1;24(5):990-991.
30. Маниатис Т, Фрич Э, Сэмбрук Дж // Молекулярное клонирование. - 1984.
31. Avoiding False in coloni PCR // BioTechniques, 1998, v.24, p. 580-582.
32. Кантор, Ч., Шиммел, П. // "Биофизическая химия", т. 2., Москва, Мир, 1984.
33. Goulian, M., Lucas, Z.J., Kornberg, A. // Enzymatic synthesis of deoxyribonucleic acid. - J. Biol. Chem.,1968, v. 243, p. 627-638.
34. Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J. // Molecular cloning: a laboratory manual.- CSHL Press, 1989, Measurement of radioactivity in nucleic acids. p.E 18-E19.
35. Varshavsky, A. // The N-end rule. - Cell, 1992, v. 69, p. 725-735.
36. New England Biolabs. 2000/01 Catalog, p.210.

53) Зелинская Н.В., Ковалевская Н.П., Матвиенко Н. Н., Железная Л.А., Матвиенко Н.И // Сайт-специфические эндонуклеаза и метилаза из термофильной бактерии Bacillus species IS4 - Биохимия, 1995, т.60, вып 9, стр. 1435-1449.

) pET System manual - Novagen. 1995, 6th edition, p. 22.

ПОЛУЧЕНИЕ СУПЕРПРОДУЦЕНТОВ ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ, РНК-ЛИГАЗЫ, ПОЛИНУКЛЕОТИДКИНАЗЫ ФАГА Т4 И ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ ИЗ T

Больше работ по теме: