»зучение вли€ни€ гумата натри€ на токсичность и биологическую активности агрохимических средств

 

¬ведение


¬ сложившейс€ в последние дес€тилети€ сложной экономической и экологической ситуации остро стоит вопрос применени€ средств, повышающих плодородие почв. ƒл€ этого обычно используютс€ органические и минеральные удобрени€, а также агромелиоративные меропри€ти€. Ќа прот€жении нескольких дес€тков лет ведутс€ работы по изучению новых веществ, способных повысить эффективность удобрений и оказать протекторное действие на культуры.

ќдной из перспективных разработок в данном направлении €вл€етс€ синтез соединений гуматов, в частности рассматриваемый в данной работе гумат натри€ ( уликова, 2008; ѕерминова ?). ѕоскольку гуматы €вл€ютс€ очень важной природной составл€ющей почв, внесение их под культуры приводит к существенным прибавкам урожа€, более того, это позвол€ет создать запас питательных веществ на следующие года.

¬ услови€х современных антропогенных экосистем особое значение имеет еще одна экологическа€ функци€ гумусовых кислот - биопротекторна€, заключающа€с€ в защите и повышении устойчивости растений при действии неблагопри€тных внешних факторов. ¬ажность этой функции подчеркиваетс€ многими авторами (ќрлов, 1990;  арпачевский, 1993;  ирюшин и др., 1993) ќднако, если в литературе достаточно широко представлены работы по исследованию взаимодействи€ ксенобиотиков с различными фракци€ми органического вещества почв, то работ по вли€нию гумусовых веществ на устойчивость растений к действию различных токсикантов пока сравнительно мало.

ƒл€ рационального использовани€ агроценозов необходимо присутствие в почве всего комплекса необходимых растени€м веществ. ¬ частности цинк €вл€етс€ одним из элементов, лимитирующих развитие растений (Ѕитюцкий, 1999; »льин, 1991). ¬ серии проведенных опытов, было показано что избыток цинка также пагубен как его острый недостаток.

»спользование серии биотестов („еремных, ¬оронина, 2007; ћинеев и др., 1991) дл€ оценки воздействи€ различных доз цинка позвол€ет получить данные по его вли€нию на живые организмы (растени€, гидробионты, микроорганизмы, и др.).

¬ данной работе примен€лс€ метод биотестировани€, включающий в себ€ биотесты на проростках растений и биотесты на инфузори€х. »сследовани€ с помощью двух методов позвол€ет сопоставл€ть полученные результаты, так, с пользование биотеста с растени€ми условно имитирует ответ целого организма, а использование теста с инфузори€ми позвол€ет получить ответную реакцию на клеточном уровне.

÷ель

»зучение вли€ни€ гумата натри€ на токсичность и биологическую активности агрохимических средств (цинковых хелатных удобрений), с привлечением двух биотест систем: растительный биотест и биотест на инфузори€х.

«адачи исследований

·ѕровести скрининг методов биотестировани€ дл€ соединений полифункционального действи€

·ѕровести биотестирование разных концентрации цинка на примере препарата –ексолин-Zn15

·ѕровести биотестирование разных концентраций гумата натри€

·ќценить действие сочетаний разных концентраций цинка и гуматов на биологические системы


1. ќбзор литературы


ѕон€тие о биотестировании


ѕод биотестированием (bioassay) обычно понимают процедуру установлени€ состо€ни€ среды с помощью тест-объектов, сигнализирующих об опасности независимо от того, какие вещества и в каком сочетании вызывают изменени€ жизненно важных функций у тест-объектов. Ѕлагодар€ простоте, оперативности и доступности биотестирование получило широкое признание во всем мире и его все чаще используют нар€ду с методами аналитической химии.

Ѕиотестирование представл€ет собой методический прием лабораторной оценки качества образцов по реакци€м подопытных организмов с известными и поддающимис€ учету характеристиками. Ѕиологический объект в биотестировании фактически используетс€ в качестве аналитического прибора или его части, при этом считаетс€ значительно более дешевым. ƒл€ биотестировани€ возможно использовани€ самых разных характеристик сообщества: на уровне попул€ции и сообщества, суборганизменном, на уровне организма, элементов клеточной структуры или органов, биохимических систем и др.. ¬озможности и эффективность применени€ этих характеристик существенно различаютс€.

“ак, методы биоиндикации, св€занные с исследовани€ми на суборганизменном уровне, могут быть весьма чувствительными к действию некоторых факторов среды, но плохо отражают качество среды в целом. Ёто относитс€ к показател€м, определ€емым и на субклеточном, и на клеточном, и на тканевом уровн€х.  оличество морфологических аномалий, увеличиваетс€ под действием антропогенных факторов также избирательно: некоторые негативные воздействи€ на этот показатель не вли€ют.  роме того, вы€снить этиологию наблюдаемых аномалий часто не удаетс€. ¬се это резко ограничивает экодиагностические возможности учета отклонений на суборганизменном уровне (ћелехова, ≈горова 2007). ѕоказателем токсического действи€ служит степень изменени€ определенных параметров живых систем, котора€ фиксируетс€ различными методами. Ёто могут быть как биохимические или биофизические методы, разные виды микроскопии, визуальный подсчет.

Ќа практике наиболее распространенными методами биотестировани€ €вл€ютс€ такие, в которых фиксируютс€, главным образом, такие интегральные параметры, как показатели выживаемости, роста, плодовитости тест-организмов.

ѕростейшими количественными показател€ми €вл€ютс€ биомасса сообщества и его численность. Ѕиомасса или численность сообщества и тенденции их изменени€ иногда позвол€ют в первом приближении судить о состо€нии экосистемы и силе испытываемого ею воздействи€.

—осто€ние такой системы в услови€х антропогенного воздействи€ может быть оценено также по показател€м, характеризующим динамику биомассы бентоса, т.к. диапазон ее сезонных и межгодовых изменений увеличиваетс€ пропорционально силе воздействи€ негативных факторов.

 роме того, биоиндикаци€ может быть основана на известном €влении увеличени€ биомассы, удельной и абсолютной продуктивности сообществ в услови€х нетоксичных дестабилизирующих воздействий (Deeborah Chapman GB.1999)

ƒл€ получени€ более надежной и полной информации о качестве среды и состо€нии экосистемы необходимо использовать более подробные характеристики сообществ.

“ак, довольно чувствительными индикаторами воздействий иногда оказываютс€ количественные показатели, учитывающие абсолютное или относительное обилие совокупно учитываемых членов сообщества, обладающих сходной жизненной стратегией. ќб ухудшении качества среды свидетельствуют увеличение доли видов "толерантных", по сравнению с "резистентными" и с "патиентными" видами (Ўуйский, ћаксимова 2002).

ƒл€ биоиндикации используетс€ также соотношение биомассы и численности (плотности), или средн€€ масса особи в сообществе. ”меньшение средней массы особи в сообществе считаетс€ признаком ухудшени€ качества среды.

¬се методы биотестировани€ характеризуютс€ своими особенност€ми. Ёто и доступность тест-объекта, котора€ определ€етс€ возможностью их культивировани€ в лабораторных услови€х, поддержанием необходимых условий температуры, освещенности, сложностью состава питательных сред, чистотой воздуха и пр. Ёто и оперативность получени€ ответа.

Ќаиболее быстрые реакции на токсическое воздействие равных концентраций удаетс€ регистрировать у простых организмов - бактерий, водорослей и инфузорий. Ќаступление таких реакций ограничиваетс€ минутами или несколькими часами. —утками измер€етс€ про€вление ответных реакций более крупных объектов (у ракообразных - дафний), а так называема€ хроническа€ токсичность оцениваетс€ в течение многих суток и даже недель.  аждый метод характеризуетс€ и своими техническими способами реализации. — точки зрени€ технического оснащени€ наиболее доступными оказываютс€ методы, основанные на регистрации общебиологических характеристик - подсчет численности или прироста попул€ций.

ƒл€ проведени€ физиолого-биохимических оценок и определени€ соотношени€, например, живых и мертвых клеток или флуоресценции тест-культур организмов необходима специальна€ серийна€ аппаратура, устройства которые до насто€щего времени производ€тс€ промышленностью в крайне недостаточном количестве (Ѕойкова , 1989)

»звестно, что живые организмы по разным причинам со временем могут мен€ть свою чувствительность, поэтому об€зательной процедурой в лаборатории €вл€етс€ контроль тест-объекта с помощью модельного токсиканта. ѕригодными дл€ анализа признаютс€ тест-системы лишь в том случае, если концентраци€ модельного токсиканта, вызывающа€ 50%-ный эффект за определенное врем€, не выходит за пределы фиксированного в описании методики диапазона.  онтроль таких параметров должен проводитьс€ регул€рно не реже 1 раза в три мес€ца.

ќпределенна€ нормативным документом процедура биотестировани€ промышленных отходов предполагает анализ водной выт€жки на острую токсичность, т.е. относительной кратковременный эксперимент (от нескольких минут до 4 суток).


“ест обьекты


“ест-объект (test organism) - организм, используемый при оценке токсичности химических веществ, почв , природных и сточных вод, донных отложений, кормов и др. “ест-объекты, по определению Ћ.ѕ.Ѕрагинского (2000) - "датчики" сигнальной информации о токсичности среды и заменители сложных химических анализов, позвол€ющие оперативно констатировать факт токсичности (€довитости, вредности) водной среды ("да" или "нет"), независимо от того, обусловлена ли она наличием одного точно определ€емого аналитически вещества или целого комплекса аналитически не определ€емых веществ, какой обычно представл€ют собой сточные воды.

“ест-объекты с известной степенью приближени€ дают количественную оценку уровн€ токсичности.

¬ажное условие правильного проведени€ биотестировани€ - использование генетически однородных лабораторных культур, так как они проход€т поверки чувствительности, содержатс€ в специальных, оговоренных стандартами лабораторных услови€х, обеспечивающих необходимую сходимость и воспроизводимость результатов исследований, а также максимальную чувствительность в токсическим веществам. (∆мур, 1997) ¬месте с тем, совершенно очевидно, что загр€знение разных типов почв отходами сопровождаетс€ с одной стороны, процессами св€зывани€ токсикантов, в частности, гуминовыми комплексами, аккумул€цией, с другой стороны, биологическим переносом и транслокацией.

ѕоэтому, дл€ анализа почвенных образцов, загр€зненных отходами, целесообразно примен€ть более широкий спектр тест-объектов, включающий почвообитающих организмов, или педобионтов.


“ест-функции


¬ качестве индикаторов используютс€ тест-функции. Ёто критерии токсичности (toxicity criterion), или жизненные функции, используемые в биотестировании дл€ характеристики отклика тест-объекта на повреждающее действие среды (ѕодунова, 1999)“ест-фукнкции, используемые в качестве показателей биотестировани€ дл€ различных объектов:

дл€ инфузорий, ракообразных, эмбриональных стадий моллюсков, рыб, насекомых - выживаемость (смертность) тест-организмов.

дл€ ракообразных, рыб, моллюсков - плодовитость, по€вление аномальных отклонений в раннем эмбриональном развитии организма, степень синхронности дроблени€ €йцеклеток.

дл€ культур одноклеточных водорослей и инфузорий - гибель клеток, изменение (прирост или убыль) численности клеток в культуре, коэффициент делени€ клеток, средн€€ скорость роста, суточный прирост культуры.

дл€ растений - энерги€ прорастани€ сем€н, длина первичного корн€ и др.


–астени€ в качестве объектов биотестировани€


ќдним из методов, обладающим высокой чувствительностью, универсальностью, интегральностью и простотой €вл€етс€ метод биотестировани€ с применением растений. ќн широко примен€етс€ дл€ определени€ токсичности веществ как в почве, так и в воде.

»тоговым результатом определени€ токсичности по тест-растению (фитотоксичность) €вл€етс€ изменение в формировании корневой системы, морфологических характеристик надземной части растени€, биомассе (общей и отдельных органов растени€). ¬опрос морфологических изменений в корневой системе в зависимости от многих факторов давно привлекает внимание исследователей. Ќа первых этапах развити€ корнева€ система растений высокочувствительна. »зменени€ внешних морфологических признаков растени€ в период вегетации весьма селективны (определЄнные изменени€ в морфологии растени€, св€заны с определЄнными факторами). Ёти особенности широко используютс€ в диагностике питани€ растений, в определении гормональной активности, и пр. ¬ насто€щее врем€ интерес к этому методу возрос в св€зи с обострением экологической ситуации и новыми технические методические возможности.

 роме оценки неблагопри€тного воздействи€, оказывающего пр€мое или опосредованное воздействие на объекты, метод широко используетс€ и дл€ оценки стимулирующей активности биологически активных веществ Ѕј¬. ћетод позвол€ет учитывать не только аллелопатическое взаимодействие, но и действие органических веществ стохастического характера (например, гуминовых веществ)


¬ли€ние цинка на развитие растений


÷инк относитс€ к биофильным элементам, поэтому как его недостаток, так и его избыток может привести к губительным последстви€м. “оксическое действие на растени€ высоких концентраций цинка может про€вл€тьс€ в нарушении поступлени€ и распределени€ других элементов. ¬ыступа€ в качестве антагониста железа, цинк вызывает хлороз растений, при этом уменьшаетс€ поглощение железа и нарушаетс€ его продвижение. ( ¬оскресенска€ и др.,1987). ќбщее содержание т€желых металлов в почвах дает представление лишь о потенциальной опасности загр€знени€, котора€ может реализоватьс€ при определенных услови€х. ¬ растени€ из почвы поступают только мобильные соединени€ химических элементов, поэтому важно рассматривать подвижные формы металлов (»льин, 1990; Ќикушина, 1994). ѕопавшие в почву т€желые металлы, прежде всего их мобильна€ форма, претерпевают различные трансформации. ќдин из основных процессов, вли€ющих на их судьбу в почве - закрепление органическим веществом.

ƒл€ цинка, учитыва€ его частый дефицит в почвах, повышение содержани€ его подвижной формы при загр€знении не такое значительное, ќно составл€ет дл€ дерново-подзолистых почв 36,18 мг/кг, а через 2 года - 7,92 мг/кг ( уликова, 2008). «агр€знение почвы т€желыми металлами оказывает вли€ние на формирование урожа€ и качество продукции (»льин, 1991).

¬ы€влено, что токсичные элементы, накапливающиес€ в растени€х, до определенного предела не оказывают отрицательного вли€ни€ на продуктивность сельскохоз€йственных культур. ќтмечаетс€ также эффект от использовани€ биологически активных веществ на рост и развитие зерновых злаковых культур и формирование урожайности.

¬ рамках исследовани€ был проведен анализ данных по существующим нормативам и предельно допустимым концентраци€м (ѕƒ ) цинка в объектах окружающей среды.


“аблица 1. ѕƒ  цинка дл€ почвы, воды и растительной продукции.

ќбъект‘орма элемента онцентраци€, мг/кгпримечани€ѕочвавалова€100ѕодвижные формы √оскомприрода ———–, є 02-2333 от 10.12.90ѕочваподвижный23«ерноваловое50‘едеральный центра госсанэпиднадзора ћинздрава –оссии. ћ”  4.1.1503-03«елЄна€ массаваловое130ѕитьева€ водаваловое23

¬ли€ние гуматов на развитие растений


‘изиологическа€ и биопротекторна€ активности относ€тс€ к важнейшим функциональным параметрам гумусовых веществ. ќни €вл€ютс€ одним из ключевых параметров экологического потенциала органического вещества почв. Ѕлагодар€ этим свойствам гумусовые вещества играют особую роль как в обеспечении высокой биологической продуктивности системы почва - растение, так и в повышении устойчивости этой системы к неблагопри€тным воздействи€м (загр€знению и т.п.).

—пособность гумусовых веществ оказывать благопри€тное вли€ние на рост и развитие растений была обнаружена  .¬. Ќефедовым (1887) еще в конце прошлого века и неоднократно подтверждалась позднее (¬аксман, 1937; “юрин, 1937). Ѕыло доказано, что гумусовые кислоты вли€ют на общий ход обмена веществ и в особенности на процессы дыхани€ и роста растений.

”становлено, что под действием гумусовых веществ у растений активизируетс€ корнеобразование, за счет изменени€ селективности клеточных мембран усиливаетс€ поступление воды и элементов питани€, что гумусовые соединени€ положительно вли€ют на все фазы митотического цикла клеток и вызывают увеличение значений митотического индекса в 1,5 раза. “акже показано положительное вли€ние гуминовых кислот на поглощение кислорода, активацию ферментных систем (каталазы, пероксидазы, амилазы, инвертазы, альдолазы и др.) и углеводного обмена, усиление образовани€ хлорофилла, увеличение содержани€ сахаров и белка в урожае. ѕри сравнении транспортного индекса поступлени€ в растени€ изотопа серебра и его подвижности в самом растении в составе комплексов серебра с различными лигандами в р€ду минеральные формы - оксалат - фульваты - гуматы оказалось, что гуминовые кислоты обеспечивают наивысшие значени€ этих характеристик (Jones, Peterson, 1986). ѕри изучении спектров сверхслабой люминесценции корней ржи и пшеницы показано (Goleblowska, Flak, 1996) благопри€тное стимулирующее действие гуматов кали€ как на общий уровень физиологических процессов в корн€х, так и на их рост.

¬ работе по исследованию воздействи€ гумусовых веществ на рост озимой пшеницы в услови€х оптимального минерального фона (Gone, 1996) установлено, что гумусовые препараты оказывали стимулирующий эффект не только на рост растений, размер и вес зерен, но и на общее содержание белка в зерне.

ќсобого внимани€ заслуживает уже давно дискутируемый в литературе вопрос о возможности проникновени€ гумусовых веществ или их фрагментов через клеточную мембрану корневых волосков в ткани растений. ћногие исследователи физиологической активности гумусовых веществ полагают, что такой процесс возможен и гумусовые вещества поступают в растительные ткани и непосредственно воздействуют на биохимические процессы внутри клетки. Ќа основе этих представлений возникают новые теории гумусового питани€ растений. ¬ соответствии с положени€ми одной из них высшие зеленые растени€ рассматриваютс€ как факультативные гетеротрофные организмы с «симбионтным пищеварением». ѕри этом предполагаетс€, что гумусовые вещества и их структурные компоненты, поступа€ через клеточную стенку корневых волосков в ткани и клетки растений, поглощаютс€ и ассимилируютс€ растением целиком и в виде достаточно крупных блоков встраиваютс€ в качестве готовых структурных элементов в ткани растени€. Ќа основе таких построений предлагаетс€ открытие новой трофической ветви биологического круговорота углерода, в которой циркулируют структурные и функциональные блоки биологических макромолекул, многократно используемых на различных трофических уровн€х .

ѕроцесс взаимодействи€ биоты и в особенности высших растений с гумусовыми веществами очень сложен и составл€ет одну из ведущих проблем в почвенном питании растений. √ипотеза поступлени€ крупных фрагментов гумусовых веществ в растени€ и встраивани€ их в готовом виде в ткани растений, несмотр€ на всю свою привлекательность, не имеет строгих научных доказательств. ƒл€ решени€ данного вопроса стали активно использовать радиоактивные изотопы углерода и других элементов, однако методические затруднени€ заметно охладили интерес к этим работам. “ак, например, в одной из первых работ по этому вопросу (Fuhr; Sauerbeck, 1967) с использованием метода автодиографии на изотопах — 14 авторы попытались доказать поступление макромолекул гумусовых веществ в корневую систему растени€. ќднако из-за того, что, во-первых, не удалось дифференцировать прочно адсорбированные на поверхности корневых волосков макромолекулы от проникших внутрь последних, а во-вторых, не было зафиксировано передвижени€ радиоактивной метки к центральному цилиндру (ксилеме) сорта, авторы сделали вывод, что транспортировка гумусовых веществ через клеточную стенку если и возможна, то только дл€ соединений ила фульвокислот. ¬ другой работе (Vaughan; Jnehan, 1976), выполненной теми же методами, но уже в модельных услови€х на проростках ржи, показано, что меченные — 1 гумусовые вещества адсорбируютс€ на поверхности корней, но не транспортируютс€ по ксилеме к проростку.

Ќа основании многолетних исследований вли€ни€ гуминовых веществ торфа на рост и качественные показатели урожа€ целого р€да сельскохоз€йственных культур (Ќаумова, 1956) было установлено, что гумусовые вещества, не проника€ внутрь растительной клетки, про€вл€ют мембранотропное действие и, активизиру€ тем самым обменные процессы в растени€х, стимулируют рост тканей, повышают их иммунитет и устойчивость к неблагопри€тным услови€м.

¬ то же врем€, несомненно, еще одним из реальных механизмов вли€ни€ гумусовых кислот на рост растений в естественных услови€х, помимо пр€мого физиологического воздействи€, €вл€етс€ („ижевский, ƒикусар, 1955) стимул€ци€ ѕ  прикорневой и симбиотической микрофлоры, в особенности грибов, которые сами выдел€ют регул€торы роста и развити€ растений. ¬ последние годы эти выдел€емые почвенными грибами вещества достаточно подробно исследовались , результатом чего €вилс€ вывод о том, что они ускор€ют как общее течение биохимических процессов вблизи поверхности клеточной стенки корневых волосков, так и выработку ауксино- и гиббереллиноподобных ростовых стимул€торов в самом растении. Ќа этой основе был предложен целый р€д эффективных регул€торов роста растений типа фузикокцина, эмистима и др. ѕо некоторым данным фузикокцин в р€де случаев превосходит гиббереллин по своему стимулирующему действию на растени€.

¬ услови€х современных антропогенных экосистем особое значение имеет еще одна экологическа€ функци€ гумусовых кислот - биопротекторна€, заключающа€с€ в защите и повышении устойчивости растений при действии неблагопри€тных внешних факторов. ¬ажность этой функции подчеркиваетс€ многими авторами (ќрлов, 1990;  арпачевский, 1993;  ирюшин и др., 1993) ќднако, если в литературе достаточно широко представлены работы по исследованию взаимодействи€ ксенобиотиков с различными фракци€ми органического вещества почв, то работ по вли€нию гумусовых веществ на устойчивость растений к действию различных токсикантов пока сравнительно мало.

“ак, например, ј.». √орова€ (1983) обнаружила, что предпосевна€ обработка сем€н сорго слабым раствором √  позвол€ет ослабить токсическое вли€ние гербицидов на митотический цикл клеток меристемы корн€. —.ј. √уминский (1968) показал, что √  стимулируют процесс дыхани€ растений в услови€х острого дефицита кислорода. ѕо данным других авторов √  снимают также отрицательное воздействие высоких доз минеральных удобрений (Chaminade, 1965), ослабл€ют вредное действие на растени€ почвоутомл€ющих веществ и радионуклидов (√орова€, 1988), помогают сн€тию токсикозов у растений. —овместное применение гуминовых препаратов с фунгицидами позвол€ет снизить ингибирующее действие последних на растени€ (Ќаумова и др., 1995). ѕрименение гуматов натри€ заметно уменьшает фитотоксическое действие некоторых групп гербицидов и стимулирует ферментативную активность почв, причем в этом процессе участвуют CP гуминовых кислот (Kozjubinskaya еt.аl., 1996). √умусовые вещества обладают выраженной антимутагенной активностью, защища€ растени€ от воздействи€ гербицидов (Stewart, 1984, De Simone е.а., 1996). ¬ работе группы исследователей из ћ√” (Perminova еt.аl., 1996) на материалах вегетационных опытов с пшеницей и кукурузой, а также в лабораторных опытах с культурами водорослей показано, что гумусовые вещества значительно ослабл€ют токсичность широкого набора ксенобиотиков (т€желые металлы, полициклические углеводороды, гербициды и др.) и €вл€ютс€, по сути, прекрасными естественными детоксикантами.

ѕри действии на клетки водоросли Nitellopsis obtlisa и огурца Cucumis satins в фитотронах на искусственных средах гуматы натри€ могут выполн€ть значительную биопротекторную функцию в услови€х дефицита железа, стимулиру€ адаптивные процессы (изменение окислительно-восстановительного потенциала плазмалеммы клеток), что повышает жизнестойкость растений в неблагопри€тных услови€х (Slesak, KowaJiszyn, 1996).

“аким образом, важна€ роль системы гумусовых кислот почвы в нормализации и стимул€ции роста и развити€ растительных организмов очевидна. ќднако большинство исследований, как это было показано выше, посв€щены изучению механизма действи€ гумусовых веществ на физиологические и биохимические процессы в растени€х, а не на рассмотрение их биопротекторных свойств.

»менно в этом направлении будут проводитьс€ дальнейшие работы с целью вы€вить защитные свойства гумусовых веществ, изучить оптимальные концентрации дл€ разного рода почв и загр€знителей.


—овместное вли€ние меди в качестве т€желого метала на развитие растений


»нтерес представл€ют работы по исследованию совместного действи€ т€желых металлов и гуматов ( уликова, 2008)

–езультаты биотестировани€ показали, что внесение гуминовых препаратов приводило к снижению токсичности меди уже при концентрации гумусовых веществ 5 мг/л, а при концентраци€х 30 мг/л и выше наблюдали полное сн€тие негативного действи€ меди. ќсобо следует подчеркнуть, что при концентраци€х √¬ 30 мг/л и выше длина корней в присутствии √¬ превышала даже контрольные значени€ дл€ проростков, проращиваемых на дистиллированной воде без внесени€ меди. (Kholodov at.el., 2004)


2. ќбъекты и методы


ѕодготовка культивационной воды


 ультивационна€ вода должна удовлетвор€ть следующим требовани€м:

отсутствие органических загр€зн€ющих веществ, хлора, токсических веществ и антагонистических дл€ парамеции организмов (простейших, многоклеточных);

рЌ - (7,0 - 8,0);

жесткость обща€ от 60 мг/дмз до 200 мг/дм (выраженна€ в —а—ќз);

концентраци€ растворенного кислорода - не менее 6 мгќ2/дмз.

температура - (+22+ 2)о—;

ѕри исследовании вод с повышенным солесодержанием (содержание сухого остатка выше 1 г/дм) провод€т предварительную постепенную адаптацию культуры тест - объектов, добавл€€ порци€ми хлористый натрий в культивационную воду (содержание солей по сухому остатку не должно превышать 6 г/дм ).

ѕолучение исходного материала, транспортировка, содержание и кормление парамеции, выращивание культуры.

¬ажное условие правильного проведени€ биотестировани€ - использование генетически однородных лабораторных культур, т.к. они проход€т поверки чувствительности, содержатс€ в специальных, оговоренных стандартами лабораторных услови€х, обеспечивающих необходимую сходимость и воспроизводимость результатов исследований, а также максимальную чувствительность в токсическим веществам.  ультуру парамеции выращивают в термостате при температуре 22о—. ¬ качестве культиваторов используют чашки ѕетри (диаметр 9 см). ѕересевают культуру инфузорий один раз в 10 дней. ƒл€ этого в чистые чашки ѕетри наливают на половину чашки, дехлорированную водопроводную воду.

¬ каждую чашку добавл€ют по 1 см суспензии дрожжей (можно добавить небольшой кусочек сухой корки банана). “аким образом, содержимое чашек становитс€ питательной средой дл€ выращивани€ парамеции.


‘орма соединени€ цинка используема€ в исследовании


¬ данной работе рассматривалась хелатна€ форма цинка (цинк-двунатриевый комплекс этилендиаминтетрауксусной кислоты [EDTA-Zn] Na2 д.в Zn 11 %) в виде препарата «–ексолин 15».


»нфузории в качестве тест объектов

caudatum Ehrenberg - одноклеточные организмы размером 180 - 300 мкм. ћассовый вид, обитающий в пресной воде с высоким содержанием органических веществ. ¬ сточной воде €вл€етс€ часто основным видом, поли-альфа-мезосапроб.

ѕростейшие, в том числе ресничные инфузории, составл€ют основную часть микрофауны активного ила. ќни участвуют в освобождении очищаемой воды от взвешенных бактериальных клеток и от рыхлых, плохо оседающих бактериальных агломератов, способству€ тем самым повышению эффективности очистки. ћетодика определени€ острой токсичности водных выт€жек из отходов, почв, осадков сточных вод, а также пресных поверхностных, грунтовых, сточных и питьевых вод с использованием инфузорий Paramecium caudatum в лабораторных услови€х основана на определении смертности парамеций при воздействии токсических веществ, присутствующих в исследуемой водной среде, по сравнению с контролем. (√роздов, 2001; ћетодическое руководство. √оскомприроды ———– от 06.08.1990).

 ультивирование инфузорий Paramecium caudatum


 ультура инфузорий предоставлены дл€ проведени€ исследований кафедрой биохимии ћосковского государственного университета прикладной биотехнологии.

»нфузории культивировали на минерально-дрожжевой среде, приготовление которой состоит из двух этапов:

ѕриготовление 10-кратного концентрированного раствора по прописи Ћозина-Ћозинского (в 1 литре дистиллированной воды раствор€ли соли; 0,1г NaCl; 0,01г KCl ; 0,01 г MgSO4; 0,01 г CaCl2 ;0,02г NaHCO3 ).

ѕриготовление питательной среды (в плоскодонные конические колбы объемом 100 см3 вносили 45 мл дистиллированной воды, 5 мл концентрированного раствора Ћозина-Ћозинского. «акрывали колбу ватно-марлевой пробкой, кип€тили 5 минут и остужали до комнатной температуры.

—реда дл€ культивировани€ инфузорий была приготовлена на дистиллированной воде стандартного качества, которую получали с помощью дистилл€тора, не имеющего в своем составе ни латунного, ни медного испарител€ или конденсатора.


јвтоматизированна€ биотехническа€ система


¬ –‘ создана автоматизированна€ биотехническа€ система, состо€ща€ из устройства ЅиоЋа“ программы AutoCiliata и методических приемов культивировани€ и проведени€ исследований с использованием в качестве тест-объектов инфузорий Stylonychia mytilus, Paramecium caudatum, Tetrahymena pyriformis.

Ќа первом этапе биотестировани€ осуществл€етс€ подсчет инфузорий Paramecium caudatum в течение 2-х часов экспозиции их в 2-х подготовленных пробах продукта, представл€ющих собой водный экстракт и разбавленный ацетоновый экстракт. ќценка прироста Tetrahymena pyriformis осуществл€етс€ на основе подсчета их в водном экстракте продукта через 24 часа после экспозиции в пробе.

ƒл€ подсчета простейших примен€етс€ автоматизированный прибор ЅиоЋа“. »нтегральна€ оценка безопасности вычисл€етс€ автоматически на основании результатов 2-х этапов биотестировани€ и в соответствии с алгоритмом программы AutoCiliata

—пособ вы€влени€ реакции инфузорий на исследуемый продукт состоит в сравнении количества этих тест-объектов через определенные промежутки времени. ѕодсчет живых клеток простейших основан на обработке изображени€ емкости дл€ проведени€ исследовани€ (лунки) программой AutoCiliata. ∆ивые инфузории - это подвижные объекты (скорость перемещени€ инфузорий может быть 0,01 - 2мм/сек) и признаками, позвол€ющими идентифицировать объект, как живую клетку, €вл€ютс€ его размеры и факт самосто€тельного перемещени€.

¬ основе формализации процесса биотестировани€ лежит принцип многократного подсчета количества тест-объектов в течение экспозиции и представление процесса изменени€ этого количества случайным процессом. –езультаты любых измерений, в том числе биологических исследований с помощью устройства ЅиоЋа“, включают ошибки измерений. “акие измерени€ в течение некоторых промежутков времени интерпретируютс€ как случайные процессы, имеющие в своем составе случайные функции ошибок.


Ѕиотест на проростках сем€н редиса


Ѕиотест на проростках сем€н редиса широко примен€етс€ дл€ оценки суммарной фитотоксичности почв. ƒл€ оценки качества почв представл€етс€ целесообразным использование в качестве тест-организмов проростки сем€н растени€. ћетод основан на высокой отзывчивости сем€н редиса на токсические вещества путем учета снижени€ длины корней проростков в растворах препаратов выт€жек из анализируемых образцов почвы, сока корневой системы и конечной продукции по сравнению с контролем, выраженное в процентах. ¬ полевых услови€х при определении суммарной токсичности контролем служит образец, отобранный с варианта опыта без нагрузки поллютантов.

ќценка длины корн€ и других характеристик проростков производитс€ вручную. ƒл€ проведени€ полноценного эксперимента необходимо измерить и оценить до 300 проростков в одной пробе.

—емена редиса, отобранные по качеству и близким размерам, помещали в химические стаканы и в течение суток замачивали водными растворами солей кадми€ или водными выт€жками из почв. —емена заливались таким количеством раствора, чтобы исключить гибель сем€н от излишней влаги или пересыхани€.  онтролем служили семена, замачиваемые водой в тех же объемах. „ерез сутки семена раскладывали на чистые чашки ѕетри с бумажными фильтрами. ¬ чашки предварительно вносили по 7 мл стерильной водопроводной воды. «атем раскладывали семена по 10 штук на чашку, которые равномерно распредел€лись по поверхности чашки. „ашки выдерживали при определенной температуре в течении двух суток. Ќа 3-и сутки после раскладывани€ сем€н определ€ли общую длину корневой системы проростков в каждой повторности, учитывали число непроросших сем€н (проросшими считались те, у которых корешок прорывал семенную оболочку). «атем рассчитывали среднюю длину корн€ взошедших сем€н в каждой повторности и среднюю длину из трех повторностей.

—нижение длины корней проростков замоченных сем€н в растворах препаратов по сравнению с контролем, выраженное в процентах, €вл€лось показателем токсичности препаратов.

биотестирование цинк гумат инфузори€

‘итотестирование с растени€ми райграса


¬ качестве тест-организмов была опробована культура газонной травы райграс. –ассматриваемый метод основан на учете образовавшейс€ вегетативной массы, сравнении результатов с контролем и последующем анализе растительного материала. ¬ данном биотесте исследовалась продуктивность данной культуры на дерново-подзолистой почве, поглощение растени€ми искусственно внесенных повышенных концентраций исследуемых веществ. »спользовались вегетационные сосуды, в которые помещалось по 600 грамм почвы, вносилс€ азот в качестве дополнительного элемента питани€, засевалась тест культура, и сосуды выставл€лись в вегетационном домике. ѕосле побеги были собраны, взвешены и высушены. —ухой материал также был взвешен и сохранен дл€ определени€ содержани€ исследуемого элемента. “акже дл€ исследовани€ были отобраны почвенные образцы дл€ дальнейшего исследовани€.


ћетодика определени€ содержани€ подвижного цинка в почве


¬ ходе исследовани€ необходимо было получить данные по содержанию цинка в почве, а также по изменению его количества при применении различных доз цинка и гумата натри€.

Ќавеску почвы из смешанного образца массой 10 грамм, помещали в конические колбы , приливали 100 мл 1н HCl взбалтывали на ротаторе в течении часа и оставл€ли настаиватьс€ на ночь. ѕосле этого содержимое колб фильтровалось, полученные почвенные выт€жки оставл€лись дл€ атомно-абсорбционного анализа (ѕрактикум по агрохимии, 1989).


3. –езультаты и их обсуждение


ќпыт на райграсе


¬ опыте на райграсе исследовалось вли€ние цинка в концентраци€х: 5, 25 и 50 мг/кг и гумата в концентрации: 1, 5 и 10% а также совместное применение гумата и цинка в максимально исследуемых концентраци€х.

ƒанные по вегетативной массе полученные по результатам опыта представлены в таблице 1.


“аблица 1. ¬егетативна€ масса райграса по результатам опыта

образецмасса% от контрол€% от комплекса Zn + гNaсырой вес, гсухой вес, гконтроль3,200,48314N+гNa 1%3,530,47110346N+гNa 5%3,900,53122382N+гNa 10%4,170,60130408N+Zn 5 мг/кг3,870,53121379N+Zn 25 мг/кг2,630,4082258N+Zn 50 мг/кг0,330,071033N+Zn+гNa1,020,2232,

»спользование гумата натри€ в разных концентраци€х привело к увеличению биомассы растений райграса от 10 до 30%.

»спользование разных доз цинковых удобрений повысило биомассу при использовании его в рекомендованной концентрации 5 мг/кг и привело к снижению биомассы при повышении дозы цинка на 5 и 55%, соответственно 25 и 50 мг/кг примен€емого удобрени€.

—овместное использование гумата натри€ на фоне высокой концентрации цинка повли€ло положительно на формирование биомассы по сравнению с вариантом с использованием высокой концентрации (50 мг/кг) цинка. Ѕиомасса увеличилась на 30%.

ћаксимальный урожай был получен при наибольшей концентрации гумата, также в 3 раза увеличилась масса образца с совместным применением цинка и гумата натри€ (–ис.1).


–ис.1. вли€ние различных концентраций гумата натри€ на биомассу растений


ѕрименение гумата натри€ положительно вли€ло на биомассу растений райграса и максимально эффективной действующей концентрацией €вилась его 10% содержание в почве. ѕро€вл€лись защитные свойства использовани€ гумата натри€ на дерново-подзолистой почве при выраженном угнетающем действии высокой концентрации цинка.


ќпределение содержани€ цинка в почве


ƒл€ оценки способности почвы удерживать цинк в недоступной дл€ растений и организмов форме, был проведен анализ по методике —оловьева. »з полученных данных видно, что в почве наблюдалось фоновое содержание цинка. ƒл€ образцов Zn 5, Zn 25 и Zn 50 наблюдалось закономерное увеличение концентраций , дл€ образцов с совместным применением Zn 50 и г Na 10% наблюдаетс€ снижени€ количества доступного цинка на 35 %.(таблица 2.)


“аблица 2 ќпределение цинка в почве

номертип образцамассасодержание Zn мкг/мл1контроль103,82N103,73N+гNa 1102,94N+гNa 5102,55N+гNa 10102,36N+Zn 51020,67N+Zn 251026,88N+Zn 501035,49N+Zn+гNa1023,5

ѕрименение цинка позволило существенно умеличить содержание этого элемента в исследуемой почве. –еккомендована€ доза в 5 мг/кг обеспечила умеличение запаса цинка в подвижной форме более чем в 5 раз(520% от контрол€), а максимальна€ концентраци€ вызвала увеличение содержани€ цинка в 9 раз (931% от контрол€). Ќа рисунке 2 показано, что применение гумата натри€ позволило снизить количество доступного цинка, и привести его к значению, близкому к полученному от реккомендованой дозы удобрени€.


–исунок 2. ƒанные по растительному материалу, определение цинка

ќпределение содержани€ цинка в вегетативном материале райграса


Ѕыло проведено исследование поглощенного растени€ми цинка и вли€ни€ гумата на эту величину. «ависимость содержани€ цинка в растении от количества цинка в почве мен€етс€ практически линейно, при совместном использовании цинка и гумата количество поглощенного цинка снизилось с 24мкг\мл до 15мкг/мл , таким образом на 34 % уменьшилось содержание этого элемента в растении.(табл 3)


“аблица 3 ƒанные по растительному материалу, определение цинка

номертип образцамассасодержание Zn мкг/мл1контроль0,5011,92N0,5031,73N+гNa 10,5021,44N+гNa 50,5071,35N+гNa 100,5041,26N+Zn 50,50510,57N+Zn 250,50917,98N+Zn 500,50623,59N+Zn+гNa0,50415,2

ѕо результатам исследовани€ было вы€влено, что применение удобрени€ в реккомендуемой дозе , увеличило содердание цинка в растительном материале в 5,5 раз (552% от контрол€), а в образцах где исследовались максимальные концентрации содержание подвижного цинка увеличилось в 12 раз(1234%от контрол€)

Ќа рисунке 3 показано, что применение гумата натри€ и дл€ растительной продукции позволило снизить количество поглощенного цинка. “аким образом в образце с совместным внесением цинка и гумата натри€ , содержание цинка увеличилось в 8 раз по сравнению с контролем.

–исунок 3 определение цинка в почве


“аблица 4 ƒанные по почвенным образцам, определение цинка

номертип образцамассасодержание Zn мкг/мл1контроль103,82N103,73N+гNa 1102,94N+гNa 5102,55N+гNa 10102,36N+Zn 51020,67N+Zn 251026,88N+Zn 501035,49N+Zn+гNa1023,5

ќпыт на инфузори€х


¬ лабораторном эксперименте исследовались растворы хелатной формы цинка в следующих концентраци€х:5, 25 и 50 мг/кг. Ѕыло установлено, что высокие концентрации цинка привод€т к летальному исходу у инфузорий, погибало от 18 до 40 % участвовавших в биотесте объектов. ѕолученные данные представлены в таблице 5 и рисунке 4


“аблица 5 «ависимость смертности инфузорий от концентрации цинка

концентраци€ мг/кг52550количество инфузорий858287767571797565696251—мертность по отношению к начальному количеству, %18,727,039,9

–ис. 4 «ависимость смертности инфузорий от концентрации цинка


ѕримечание: 1-количество инфузорий в лунке на начало эксперимента (до внесени€ растворов); 2, 3, 4 -количество инфузорий по данным замеров через 10, 20 и 30 минут соответственно .

—тоит отметить, что дл€ малых концентраций цинка характерен эффект токсикации и интоксикации (восстановлени€ ) активной двигательной способности инфузорий.

ƒостоверна€ токсичность по результатам эксперимента установлена при использовании цинка в концентраци€х 25 и 50мг/кг.(погибало более 20 % особей)

ѕри рекомендованной дл€ использовани€ концентрации наблюдалась тенденци€ к сокращению численности. »сследование гумата натри€ не вы€вило признаков токсичности, тест обьекты практически не мен€ли своей двигательной активности, наблюдалось стабильное выживание. ƒл€ всех концентраций замечалось некоторое увеличение активности на второй стадии опыта, соответствующей отметке в 20 минут от начала эксперимента, но к концу опыта инфузории восстанавливали первоначальные показатели.

ƒинамика во времени показана на графике 5, данные в таблице 6.


“аблица 6 «ависимость смертности инфузорий от концентрации гумата натри€

 онцентраци€ %контроль<1%1%5%10%количество инфузорий7553534741735554484573555648447250504642—мертность по отношению к начальному количеству, %4723

 ак видно на рисунке 5, дл€ всех исследуемых концентраций реакци€ проходила одинаково, что позвол€ет предполагать отсутствие вли€ни€ дозы гумата на активность тест обьектов.


–ис 5 «ависимость смертности инфузорий от концентрации гумата натри€


ѕримечание: 1-количество инфузорий в лунке на начало эксперимента (до внесени€ растворов); 2, 3, 4 -количество инфузорий по данным замеров через 10, 20 и 30 минут соответственно .

ѕри совместном применении гумата натри€ и цинка в максимальных рассматриваемых концентраци€х наблюдалось снижение смертности тест объектов по сравнению с образцами ,где был внесен только цинк. “ак смертность снизилась с 39 % до 17% от начального количества. ƒанные представлены в таблице7 и рисунке 6.


“аблица 7 —опоставление данных по смертности в образцах с внесением цинка отдельно и в комплексе с гуматом натри€

веществоZn 50 +г Na 10Zn 50контрольколичество инфузорий888775837173776573735172—мертность по отношению к начальному количеству, %1740

Ќа рисунке 6 показано изменение количества инфузорий при внесении к цинку гумата натри€. «аметно, что это позволило заметно сократить смнртность, что позвол€ет судить о снижении данным препаратом токстического эффекта.


–ис 6 —опоставление данных по смертности в образцах с внесением цинка отдельно и в комплексе с гуматом натри€.

ѕримечание: 1-количество инфузорий в лунке на начало эксперимента (до внесени€ растворов); 2, 3, 4 -количество инфузорий по данным замеров через 10, 20 и 30 минут соответственно.

¬ контрольном растворе инфузории стабильно выживали, так дл€ п€ти проведенных контрольных замеров количество тест объектов снизилось в среднем на 4 % , что может быть вызвано погрешностью метода, или особенност€ми поведени€ инфузорий. ƒанные представлены в таблице 8 и рисунке 7.


“аблица 8 »зменени€ численности инфузорий в контрольных образцах

повторность12345 оличество инфузорий7381777176678077687367857871756886726573

–ис 7 »зменени€ численности инфузорий в контрольных образцах


ѕримечание: 1-количество инфузорий в лунке на начало эксперимента (до внесени€ растворов); 2, 3, 4 -количество инфузорий по данным замеров через 10, 20 и 30 минут соответственно ..


ќпыт на проростках сем€н редиса


¬ лабораторном эксперименте на проростках сем€н редиса с применением различных концентраций цинка были использованы растворы хелатной формы цинка в следующих концентраци€х:5, 25 и 50 мг/кг. “акже исследовалс€ гумат натри€ следующих концентраций 1, 5 и 10%

ƒл€ серии опытов с растворами заданных концентраций были получены следующие результаты, приведенные в таблице 9 и рисунке 8.


“аблица 9 «ависимость длины корней от используемых концентраций веществ.

образецсреднее значениедол€ в процентах от контрол€ с дистилл€томдистилл€т20,1гумат <17,0135г Na 12,2811г Na 51,9210г Na 101,497Zn 57,3036Zn 255,6128Zn 503,3517Zn+г Na7,3937

–исунок 8 «ависимость длины корней от используемых концентраций веществ.

ѕри совместном применении цинка и гумата длина корней увеличилась с 17 до 37% от контрольного образца с дистилл€том, что в действительных величинах составило изменение длины от 3, 5 до 7, 5 см, или 46 %.

¬ опытах с выт€жками из почвенных образцов под культурой райграса с теми же внесенными концентраци€ми цинка и гуматов были получены следующие результаты. приведенные в таблице 10 и рисунке 9.


“аблица 10.«ависимость длины корней от используемых концентраций веществ.

образецсреднее значениедол€ в процентах от контрол€ с дистилл€томдистил€т20,69контроль почва21,45104азот N25,10121г Na 132,91159г Na 534,16165г Na 1035,43171Zn 519,9196Zn 2519,2493Zn 5017,5985Zn+г Na24,08116

–исунок 9 «ависимость длины корней от используемых концентраций веществ.


«аметно, что в комплексе с питательными компонентами почвы гумат дает прибавку по длине корней от 160 до 171 % в сравнении с контролем на дистилл€те (при концентраци€х от 1% до 10% соответственно).

¬ образцах с внесенным цинком наблюдалось угнетение относительно образцов с гуматом и образцов на почвенной выт€жки из используемой дерново- подзолистой почвы . ¬ образце с совместным внесением гумата и максимально рассматриваемой концентрации цинка наблюдаетс€ прибавка длинны корн€ относительно образца отдельно с цинком на 26 % (от 85% до 116 % от контрол€ с дистилл€том) и угнетение относительно образца отдельно с гуматом максимально рассматриваемой концентрации на 32 % (от 171% до 116% от контрол€ с дистилл€том).


¬ыводы


ѕо полученным данным видно, что необходимо с большой ответственностью подходить к применению микроудобрений, и в частности рассматриваемого в данной работе препарата –ексолин 15. ≈го применение в рекомендованных концентраци€х на вегетационных опытах позволило увеличить урожай на 20 процентов, что позвол€ет судить о нем, как об эффективном удобрении. —одержание цинка в продукции возросло в сравнении с контролем, но осталось в рамках допустимых концентраций 10 мг\кг при максимально разрешенной по нормативам 130 мг\кг. —овершенно друга€ картина наблюдалась при превышении рекомендованной дозы. ”рожай понизилс€ на 20 процентов при превышении дозы в 5 раз, а при превышении в 10 раз наблюдалась сильнейша€ токсикаци€ и практически полное отсутствие развити€ растени€.

–ассматрива€ результаты исследовани€ гуматов на примере гумата натри€, можно с уверенностью за€вить, что применение данного препарата позвол€ет значительно снизить негативное вли€ние веществ, токсичных при высоких концентраци€х. ћаксимальный эффект был получен при применении 10% концентрации гумата натри€. ¬о всех видах проведенных биотестов удалось снизить угнетение и даже гибель организмов не менее чем на треть. Ёто довольно существенный результат, показывающий перспективность применени€ подобных соединений при хоз€йственном использовании. »спользование гумата натри€ снижало количество доступного цинка в почве и количество этого элемента поглощенного растени€ми на 30 процентов, а также позволило полностью сн€ть отрицательный эффект от превышени€ концентрации цинкового удобрени€, показав даже некоторую прибавку урожа€ в сравнении с контрольными образцами.

»спользование методик биотестировани€ позволило оценивать эффект, оказываемый исследуемыми препаратами на биологические обьекты - растени€ и одноклеточных животных. — точки зрени€ агрохимической науки это позвол€ет судить как об эффективности удобрений, о наиболее оптимальной концентрации и возможных последстви€х от несоблюдени€ нормативов внесени€ на урожай, так и об эффекте, оказываемом продукцией на живые организмы. Ќа основе проведенной работы, можно отметить достаточно высокую репрезентативность и воспроизводимость результатов используемых биотестов; возможность оценить не только количества исследуемых веществ, но и непосредственный эффект на живые организмы. ќперативность и отзывчивость на изменени€ искусственно созданной среды отличают все виды проведенных тестов, как растительных, так и животных.

ƒальнейша€ работа должна быть направлена на совершенствование методики биотестов и построени€ комплекса дл€ определени€ токсичности и состава исследуемой почвы или растительных образцов, исследование протекторных свойств гуминовых веществ и оценки вли€ни€ микроудобрений в повышенных концентраци€х.


—писок литературы


1.јлексеев ё. ¬. “€желые металлы в почвах и растени€х. // Ћ.: јгропромиздат. 1987. 141с.

.Ѕитюцкий Ќ.ѕ. ћикроэлементы и растение. ”чебное пособие. —пб 1999

.Ѕойкова Ё.я. ѕростейшие биомониторы морской среды. //–ига,. «инатне, 1989, 265с.

.Ѕрагинский Ћ.ѕ. ћетодологические аспекты токсикологического биотестировани€ на Daphnia magna Str. и других ветвистоусых ракообразных (критический обзор) // √идробиол. журн. - 2000. - “. 36, N 5. - —. 50-70.

.Ѕрагинский Ћ.ѕ. ћетодологические аспекты токсикологического биотестировани€ на Daphnia magna Str. и других ветвистоусых ракообразных (критический обзор) // √идробиол. журн. - 2000. - “. 36, N 5. - —. 50-70.

.¬.‘. ≈втюхин, “. .Ќикушина ¬ли€ние многолетнего применени€ минеральных удобрений на некоторые агрохимические и экологические показатели серой лесной т€желосуглинистой почвы проблемы агрохимии и экологии , 2008, N 2, с. 13-18

.¬аксман —.ј. √умус. ћ.: ќгиз-сельхозгиз, 1937. 471 с.

.¬оскресенска€ ќ.Ћ.; „ернавина ».ј.; јксенова ¬.ј. ¬ли€ние избытка цинка в среде произрастани€ на поглощение металлов растени€ми овса. ‘изиологи€ устойчивости растений Ќечерноземной зоны –—‘—–, 1987

.√олубкова Ё.√. Ёкологи€ Paramecium caudatum в услови€х острой и хронической интоксикации //јвтореф.канд.дисс. ѕетрозаводск,1980

.√орова€ ј.»., ќрлов ƒ.—., ўербенко ќ.¬. √уминовые вещества.  иев: Ќаук. думка, 1995. 304 с.

.√орова€, ј.». –оль физиологически активных веществ гумусовой природы в повышении устойчивости растений к действию пестицидов / √орова€ ј.». // Ќƒ¬Ў Ѕиологические науки. - 1988. - є 7. - —. 5-16.

.√орова€, ј.». –оль физиологически активных гумусовых препаратов в регул€ции процессов клеточного цикла / ј.». √орова€, ј.‘.  улик // –егул€ци€ клеточного цикла. -  иев, 1985. - —. 101-109

.√роздов ј.ќ. ќпределение общей токсичности на инфузори€х парамеци€х // омбикорма, є4,2001

.√уминский —.ј. ѕроцессы дыхани€ в услови€х острого дефицита кислорода.ћ.1968

.∆мур Ќ.—. √осударственный и производственный контроль токсичности методами биотестировани€ в –оссии. - ћ.: ћеждународный ƒом сотрудничества, 1997. 114 с.

.»гнатьев ј.ƒ., Ўаблий ¬.я. »спользование инфузорий Tetrahymena как тест-объект при биологических исследовани€х ћ., 1978

.»льин ¬. Ѕ. “€желые металлы в системе почва-растение. Ќовосибирск: Ќаука.—иб.отд..1991.151 с.

.»льин ¬.Ѕ. “€желые металлы в системе почва-растение. Ќовосибирск: Ќаука, —ќ, 1991. 151 с.

.ћелехова ќ. ѕ. , ≈. ». ≈горова, “. ». ≈всеева и др.; под ред. ќ.ѕ.ћелеховой и ≈.».≈горовой Ѕиологический контроль окружающей среды: биоиндикаци€ и биотестирование «јкадеми€», 2007. - 288 с.

.ћетодическое руководство по биотестированию воды –ƒ 118-02-90 ”твержден √оскомприроды ———– от 06.08.1990. #37.

.Ќаумова, Ќ. Ѕ. »сследование вли€ни€ гуминовых веществ торфа на показатели урожа€/ - —.84-87. 1956

.ѕищулина Ќ. Ћ. ¬ли€ние “ћ на растени€ // »зучение, охрана и рациональное использование природных ресурсов. “.2 -”фа, 1989, с.27

.ѕодунова Ћ.√. ћетодическое пособие. јльтернативные методы исследований (экспресс-методы) токсиколого-гигиенической оценки материалов, изделий и объектов окружающей среды. \\ ћосква, √оскомсанэпидемнадзор, 1999г

.–емпе ≈.’., ћинеев ¬.√., ¬оронина Ћ.ѕ. Ѕиотест дл€ определени€ экологических последствий применени€ ’—«–// ж. ƒоклады ¬ј—’Ќ»Ћ, є7, 1991, 5-10;

.–уководство по определению методом биотестировани€ токсичности вод, донных отложений, загр€зн€ющих веществ и буровых растворов. - ћ.: –Ё‘»я, Ќ»ј-ѕрирода, 2002.

26.—айт  убанского государственного аграрного университета http://af.kubagro.ru/kafedry/cytology/sait-lemna/pr.htm <http://af.kubagro.ru/kafedry/cytology/sait-lemna/pr.htm>

.—айт лаборатории экологической токсикологии и водной экологии ”ниверситет √ент, Ѕельги€ http://www.microbiotests.be <http://www.microbiotests.be/>

.—айт посв€щенный проблемам биотестировани€ http://bioassay.narod.ru/biotest/biot.html

.—еменченко ¬.ѕ. ѕринципы и системы биоиндикации текучих вод. - ћинск: "ќрех", 2004. - 125 с.

.“ерехова ¬.ј., –ахлеева ј.ј.,  удр€шов —.¬., ƒолбнева ≈.ј., яковлев ј.—. Ѕиологические методы определени€ экологической токсичности почв и класса опасности отходов // ћеждунар. школа «—овр. методы эколого-геохимической оценки состо€ни€ и изменений окружающей среды». Ќовороссийск, 2003.

.“ома —.»., ¬еликсар —.√. ћикроэлементы как фактор оптимизации минерального питани€ и управлени€ адаптивностью растений//—овременное развитие научных идей ƒ.Ќ.ѕр€нишникова.- ћ.: Ќаука, 1991, с.242-253.

.“юрин ».¬.ќрганическое вещество почв и его роль в почвообразовании и плодородии. ”чение о почвенном гумусе, ћ.- Ћ., 1937

.‘леров Ѕ.ј., ∆мур Ѕ.—. Ѕиотестирование с использованием цериодафний // ћетодическое руководство по биотестированию воды. –ƒ-118-02-90. - ћ.: 1991. - —.19-28.

.’олодов ¬.ј.  оваленко ј.Ќ. уликова H.A.Ћебедева √.‘.ѕерминова ».¬. ƒетоксицирующа€ способность нативных и химически модифицированных препаратов угл€ по отношению к меди ћосква 2004

.÷аценко Ћ. ¬., ћалюга Ќ. √. –€сковые - биоиндикаторы агроценоза: ћонографи€ /  уб√ј”,  раснодар, 2000. - 76с.

.„еремных ≈.√. ¬оронина, Ћ.ѕ. . .јвтоматизаци€ биотестировани€ на основе обработки изображени€. ¬естник мгу є3 2007.

.Ўуйский.».‘, ћаксимова ≈.», Ѕиоиндикаци€ качества водной среды, состо€ни€ пресноводных экосистем и их антропогенных изменений. —б.научн. докл 7 межд.  онф «экологи€ и развитие с.з росии»—пб 2002.

38.Chaminade R. Action de l'acide humique sur le development et la nutrition minerale des vegetaux. Trans.6th Intern.Cong.Soil Sci.,4,443-448.(1956)

.Chaminade R. and Blanchet R. . Mecanisme de l'action stimulante de l'humus sur la nutrition minerale des vegetaux. C.R.Acad.Sci.(Paris), 237,1768-1770.(1953)

40.Davidchik V.N., Kulikova N.A., Koroleva O.V. 2004: Laccase stabilization in the presence of coal humic acids. 2004: Proceedings of the XII Int. Meeting of IHSS Humic Substances and Soil 2004, 545-546and Water Environment. Sao-Pedro, Brazil, July 25-30,

41.Deeborah Chapman/Water quality assessments-A guide to use biota Sediments and water in environmental monitoring.GB.1999.

.Elsokkary I.H.; Lag.L. Distribution of different fractions of Cd, Pb,Zn and Cu in industry polluted and non-polluted soils of Odda region, Norway// Acta Agric.Scand/1978, 28,262-268

43.Gone G.U. Humus Pile, Sincronía: An E-Journal of Culture Studies, 1996

.K. C. Jones and P. J. Peterson Gold uptake by perennial ryegrass: The influence of humates on the cycling of gold in soils Biogeochemistry Springer Netherlands Volume 7, Number 1

.Kholodov V.A., Kovalenko A.N., Kulikova N.A., Lebedeva G.F., Perminova I.V.189-191.

.Liang, J.; Karamanos, R. E. DTPA-extractable Fe, Mn, Cu andZn. In Soil Sampling and Methods of Analysis, 1st ed.; Carter,M. R., Ed.; Canadian Society of Soil Science, Lewis Publishers: Boca Raton, FL, 1993; pp 87-90

.Mitchell J. W., Gregory L. E. Nature New Biol., 1972, v. 239, є 95

.Mount D.I., Norberg T/J/ A seven-day life-cycle cladoceran toxity test // Environ. Toxicol. Chem. - 1984. - V. 3. - P. 425-434.

.Slesak, ≈. Y J. growth and nutrient content of cucumber (Cucumis sativus) plants.1988. Acta Univ. Acta Univ. Wratislaviensis 888, 13-19. Wratislaviensis 888, 13-19

.Stewart J .De Simone. Effects of land-use changes on humus forms on alpine pastureland (Central Alps, Tyrol) Geoderma, Volume 124, Issues 3-4, February 1996, Pages 215-222

.Takkar, P. N.; Walker, C. D. The distribution and correction ofzinc deficiency. In Zinc in Soils and Plants; Robson, A. D., Ed.;Developments in Plant and Soil Sciences 55; Kluwer Academic Publishers: Dordrecht, The Netherlands, 1993; pp 151-160.

.Vaughan, D. and Linehan, D.J., . The growth of wheat plants in humic acid solutions. Plant Soil. 44: 445-449. 1976


¬ведение ¬ сложившейс€ в последние дес€тилети€ сложной экономической и экологической ситуации остро стоит вопрос применени€ средств, повышающих плодороди

Ѕольше работ по теме:

ѕредмет: Ѕиологи€

“ип работы:  урсова€ работа (т)

найти  

ѕќ»— 

Ќовости образовани€

 ќЌ“ј “Ќџ… EMAIL: MAIL@SKACHAT-REFERATY.RU

—качать реферат © 2018 | ѕользовательское соглашение

—качать      –еферат

ѕ–ќ‘≈——»ќЌјЋ№Ќјя ѕќћќў№ —“”ƒ≈Ќ“јћ