Использование молекулярно-генетических методов в методико-биологических исследованиях

 

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«КЕМЕРОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

Биологический факультет

Кафедра генетики

Курсовая работа

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ В МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ

Измайлова Антонина Владимировна

Научный руководитель:

к.б.н., доцент Волков А.Н.

КЕМЕРОВО, 2010

Оглавление

Введение

Глава 1. Обзор литературы

.1История изобретения и принцип ПЦР

1.2Преимущества ПЦР и возможные ошибки при реализации методики

1.3Особенности ПЦР в «реальном времени»

1.4Практическое использование ПЦР

.5Применение ПЦ в ветеринарии

Выводы

Литература

Введение

Полимеразная цепная реакция (Polymerase chain reaction), более известная как "ПЦР" (PCR) не сходит с заголовков статей научных журналов с тех пор, как была открыта Кэри Б. Мюллисом в 1983 году, за что он и был удостоен Нобелевской премии. Причина достаточно проста: ПЦР делает невозможное возможным.

Благодаря своим достоинствам, метод ПЦР широко применяется для диагностики вирусных и бактериальных инфекций, наследственных и онкологических заболеваний, в эпидемиологии, в генетике, для HLA-типирования, в судебной медицине, для определения отцовства и идентификации личности, в биотехнологии, в области сертификации пищевого сырья и продуктов питания (Малкова, 1994).

Метод ПЦР особенно эффективен при выявлении трудно культивируемых, некультивируемых, требующих сложной питательной среды и персистирующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях (Мухина, 2002).

Диагностические возможности ПЦР не ограничены способностью микроорганизма расти на искусственных средах или в культуре клеток. Поэтому основное преимущество ПЦР перед культуральными методами состоит не в высокой чувствительности ПЦР-метода (поскольку их чувствительность сопоставима), а в способности идентифицировать, определять свойства и работать с большим разнообразием микроорганизмов, которые не удается по тем или иным причинам размножать в лабораторных условиях.

На сегодняшний день накоплен богатый опыт в теории и практике ПЦР. Однако наряду с успехами, связанными с внедрением ПЦР в клиникодиагностических лабораториях, нередко можно встретить недоверие к этому методу из-за ошибок, приводящих к некорректным результатам. В основном такие ошибки возникают на этапе забора материала для исследования. Так избыток слизи или гемоглобин могут вызвать ингибирование реакции, что приведет к ложноотрицательному результату.

Цель курсовой работы:

сбор и систематизация литературного материала по вопросу применения молекулярно-генетических методов для решения задач медицины и ветеринарии.

Задачи:

. Изучение истории становления современных молекулярно- генетических методов;

. Ознакомление с методическими аспектами различных вариантов ПЦР;

. Характеристика направлений использования ПЦР- диагностики.

Глава 1. Обзор литературы

.1 История изобретения и принцип ПЦР

Впервые идею полимеразной цепной реакции (ПЦР) озвучил Карри Мюллис (Kary Mullis) весной 1983 года будучи сотрудником биотехнологической компании Cetus Corporation, расположенной в Калифорнии, США. Первая публикация, содержащая краткое описание метода ПЦР, вышла в 1985 году в Science, в данной работе метод был использован для детекции мутаций в тотальной ДНК человека для поиска мутаций, связанных с серповидноклеточной анемией. В течение двух последующих лет авторы метода опубликовали массу работ, в которых метод ПЦР был описан более подробно.

Появлению метода проведения полимеразной цепной реакции предшествовали определенные достижения молекулярной генетики: к тому времени уже были расшифрованы нуклеотидной последовательности геномов ряда микроорганизмов и выделены специфические.

Также появлению ПЦР много способствовало открытие уникального фермента ДНК-полимеразы (или taq-полимеразы). Именно этот фермент катализирует и «контролирует» все процессы во время проведения анализа методом ПЦР. Особенность этого фермента - он термостабилен, исключительно термостоек: он выдерживает нагревание до температуры кипения без потери активности, а «любимый» его температурный режим во время работы - 72?С. Многие реакции при проведении ПЦР идут почти исключительно при повышенной температуре (Бутенко, 2005).

.2 Преимущества ПЦР и возможные ошибки при реализации методики

Одним из важнейших критериев диагностической эффективности любого лабораторного анализа является показатель «чувствительности». При этом следует различать аналитическую и диагностическую чувствительность. Аналитическая чувствительность, применительно к ПЦР, представляет собой то минимальное количество копий (геномных эквивалентов-г/э) ДНК или РНК в одном миллилитре раствора образца, которое может быть определено данной тест-системой. Большинство коммерческих амплификационных тест-систем позволяет обнаружить в биологической пробе искомую НК если ее концентрация составляет не менее нескольких сот г/э копий в 1 мл образца. Например, аналитическая чувствительность большинства тест-системы для ВИЧ-1 составляет 300-500 копий ДНК в 1 мл образца. Диагностическая чувствительность определяется количеством пациентов с данным заболеванием, дающих истинно положительные результаты при использовании конкретного набора и оценивается в процентах. В этом аспекте имеется общее положение, определяющее клиническую пригодность любых лабораторных способов диагностики или тест-систем - диагностическая чувствительность метода не должна быть ниже 95-98%.

Второй универсальный критерий лабораторной эффективности - «специфичность», определяется процентом здоровых людей, имеющих истинно отрицательные результаты анализа. Метод ПЦР обладает высочайшей специфичностью, которая достигает 99-100%.

Диагностическая чувствительность и специфичность ПЦР сопоставимы, а зачастую и превосходят таковые, обеспечиваемые культуральным методом, которые являются «золотым стандартом» в диагностике инфекционных заболеваний. Если учесть продолжительность процедуры выращивания культуры клеток (от нескольких недель до нескольких месяцев), то преимущество метода ПЦР становится несомненным. Результаты ПЦР-анализа можно получить в течение одного рабочего дня, при этом отобранные для анализа пробы могут храниться (накапливаться) в течение даже нескольких недель при соблюдении соответствующих температурных норм (Петрова, 2000).

Проведенная в нескольких зарубежных исследовательских центрах суммированная оценка чувствительности различных методов диагностики показала, что "быстрые" или экспресс-тесты имеют чувствительность 40-60%, ИФА - 50-70%, прямая иммунофлюоресценция (ПИФ) - 55-75%, культуральное исследование - 60-80%, а ПЦР от 90 до 100%.

Поэтому ПЦР, по сравнению с другими способами обладает двумя важными преимуществами: высокой чувствительностью и непродолжительностью по времени анализа, т.е. «актуальностью» получения результата исследования врачом и пациентом (Самсонова, 2004).

Таким образом, приведенные выше факты позволили отметить следующие преимущества ПЦР перед другими методами клинической лабораторной диагностики:

Универсальность

Метод принципиально позволяет обнаруживать любые ДНК и РНК даже в тех случаях, когда другими способами это сделать невозможно.

Вне зависимости от объекта и области применения ПЦР (клиническая медицина, криминалистика, ветеринария, генетика, молекулярная биология) используется стандартный комплект приборов. Это обуславливает универсальность процедуры постановки ПЦР при исследовании любых биологических объектов.

Специфичность

Высокая специфичность (100%) метода обусловлена тем, что в исследуемом материале определяется уникальный фрагмент НК (нуклеотидная последовательность), характерный только для данного возбудителя или гена. Таким образом, ПЦР - диагностикумы дают возможность избежать проблем, связанных с перекрестно-реагирующими антигенами.

Чувствительность

Возможность проведения не только качественной (наличие), но и количественной (концентрация) оценки содержания НК. В настоящее время реальный порог чувствительности коммерческих амплификационных тест-систем позволяет определять единичные копии в исследуемом образце.

Актуальность ответа (быстрота получения результата)

Высокая технологичность и автоматизация метода позволяет получить результаты исследования в руки врача и пациента в день проведения анализа.

Возможность доклинической и ретроспективной диагностики

ПЦР позволяет осуществить определение патогена или дефектного гена в организме ещё до развития заболевания. Например, при инфекциях в инкубационном периоде, т.е. серонегативной фазе или при латентном характере заболевания. Кроме того, возможно проведение ПЦР в архивном (фиксированном) материале или биологических остатках, что важно для идентификации личности или отцовства.

Проведение анализа возможно в минимальном объеме пробы (до нескольких микролитров), что крайне важно в неонатологии, судебной медицине, клинической генетике и т.п.

Возможность одновременной диагностики нескольких возбудителей заболеваний или аномальных генов в одной пробе без ущерба для чувствительности или специфичности результата.

Возможность экспертизы

Полученные результаты ПЦР возможно вносить в компьютерные информационные носители или фотографии для оценки независимыми экспертами (Петрова, 2000).

Несмотря на вышеуказанные достоинства метод ПЦР все же не лишен

некоторых недостатков, которые следует учитывать при оценке результатов исследований.

С точки зрения получения ложноотрицательного или ложноположительного результата особенно опасны ошибки, контроль которых невозможно осуществить во время проведения ПЦР-анализа. Это, прежде всего, ошибки, связанные с нарушением правил забора, хранения и транспортировки проб. Поскольку, эти процедуры могут осуществляться вне ПЦР-лаборатории, большое внимание следует уделять обучению медицинского персонала, выполняющего забор проб, так как именно от него во многом зависит качество ПЦР-анализов. Случаи тотальной контаминации выявляются без труда по появлению линии "положительной" ДНК во всех пробах, включая отрицательный контроль. Реагенты, загрязненные "положительной" ДНК, подлежат ликвидации. Повторная реакция ставится с новыми реагентами.

Вторую группу составляют ошибки, связанные с неверной диагностической стратегией врача, использующего ПЦР-диагностику. Приведем примеры таких ошибок.

Первая, когда не учитывает специфичность используемых тест-систем. Больной А. с предполагаемым диагнозом "респираторный хламидиоз" направлен на исследование хламидий в соскобе с задней стенки глотки. При постановке ПЦР использовалась видоспецифическая тест-система, выявляющая фрагмент генома С.trachomatis. Результат исследования отрицательный. Врач снимает предполагаемый диагноз. Однако у больного может иметь место инфекция, вызванная С. pneumonia, C. pecorum, C. psitaci, которые не улавливаются данной тест-системой. Поэтому при назначении ПЦР-исследования больному врач должен четко представлять границы специфичности применяемых тест-систем.

Врач не учитывает особенности персистенции и элиминации возбудителя. Больная Б. с хроническим хламидийным цервицитом направлена на контрольное исследование через 1 неделю после окончания курса антибиотикотерапии. Результат анализа положительный. Делается вывод о неэффективности проведенной терапии. Такое заключение может быть ошибочно в силу того, что погибшие и персистирующие хламидии дают положительный результат ПЦР-анализа. Окончательный вывод об излеченности можно сделать не ранее, чем через 5-6 недель после курса антибиотикотерапии. Это срок необходим для смены эпителиального слоя, в клетках которого паразитируют хламидии.

Вторая - клиническая, заключающаяся в неоднозначной прогностической оценке положительного результата ПЦР. Именно этот факт зачастую является необоснованным аргументом практических врачей для сомнения в полученном результате и эффективности метода ПЦР. Поясним на примере. Показано, что только у 40% - 60% лиц с обнаруженной в крови методом ПЦР ДНК цитомегаловируса клинически может развиться заболевание. В данной ситуации при оценке результатов исследования, совершается типичная ошибка, заключающаяся в отождествлении двух принципиально различных понятий - "инфицированность" и "инфекционная болезнь".

Таким образом, недостатки ПЦР лежат не в сути метода, а в неправильном методическом подходе (алгоритме лабораторной диагностики) при обследовании пациента и неверной клинической интерпретации полученных результатов (<#"justify">1.4 Практическое использование ПЦР

Определение этиологии инфекции (т.е. какой именно микроорганизм или их сочетание вызвали воспалительный процесс). Для некоторых возбудителей, например, Mycoplasma genitallium (010102), ПЦР - это единственный метод диагностики на сегодняшний день. В зависимости от ответа на данный вопрос вырабатывается тактика лечения (Бутенко, 2005).

Определение количества возбудителя. Особенно это актуально для условно-патогенных микроорганизмов (Gardnerella vaginalis (010202) и др.), которые вызывают патологию только при определенных условиях (например, при повышении концентрации).

Осуществление контроля течения инфекционного процесса и оценка эффективности лечения. Однако необходимо учитывать тот факт, что ПЦР может улавливать даже единичные фрагменты ДНК, которые могут оставаться некоторое время после лечения, в связи с чем, контроль эффективности проводимой терапии рекомендуется проводить не ранее чем через 2-3 недели после ее окончания.

Благодаря своей высокой чувствительности, ПЦР позволяет выявлять возбудителя даже при минимальном его содержании. Особенно это актуально при бессимптомном течении инфекционного процесса, вызванного безусловно-патогенными микроорганизмами (гонорея, трихомоноз (020201), хламидийная инфекция (010001)). Например, при хронической гонорее у женщин даже с помощью бактериологического метода часто не удается выявить гонококк, несмотря на имеющиеся симптомы хронического воспалительного процесса в шейке матки или уретре (Мухина, 2002).

Проводилось обследования 38 новорождённых детей с врождёнными пороками развития для выявления роли вируса краснухи в этиопатогенезе заболевания с использованием метода РТ-ПЦР. РНК вируса краснухи выделена у 65,8% новорождённых с пороками развития. Клиническая картина у детей с ВПР, инфицированных вирусом краснухи, соответствовала степени деформации жизненно важных органов и систем, а так же генерализованной форме внутриутробной инфекции и не имела специфических признаков. При инфицировании плода во время беременности и формировании ВПР не происходит элиминации вируса, а возникает течение хронического инфекционного процесса. Отсутствие специфических признаков врождённой краснушной инфекции требует исследования для обнаружения РНК вируса краснухи всех новорождённых с пороками развития и клиникой внутриутробной инфекции. Положительные результаты ПЦР были получены у 25 новорождённых (65,8%). В результате проведения РТ-ПЦР РНК вируса краснухи была выделена у детей с ВПС в 31,6% случаев, у детей с пороками ЦНС- в 15,8%, при аномалиях строения опорно-двигательного аппарата- в 7,9% и при МПР- в 10,5% случаев (относительно всех обследованных детей). При анализе отдельных групп больных установлено инфицирование вирусом краснухи в 66,7% у новорождённых детей с ВПС, 75% детей с пороками ЦНС,60% детей с аномалиями скелета и 57,1%- с МПР (Резник, 2005).

Тест-система для выявления РНК вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки методом ОТ-ПЦР.

Крымская геморрагическая лихорадка (КГЛ) - это острое вирусное природно-очаговое лихорадочное заболевание человека, характеризующееся общей интоксикацией, наличием выраженного геморрагического синдрома и высокой летальностью - от 10 до 50 % (в зависимости от пути передачи возбудителя).

Метод ПЦР позволяет выявлять нуклеиновые кислоты вирусов в клиническом материале в первые дни болезни, когда по причине отсутствия специфических антител серологические методы диагностики оказываются не эффективными. ПЦР можно применять также для идентификации выделенных вирусных штаммов и для выявления РНК вируса в полевом материале (Аристова, 2001).

Клиническая оценка метода ПЦР в диагностике острых кишечных инфекций.

Доказана высокая чувствительность метода ПЦР при вирусных гепатитах, ВИЧ-инфекции, герпетических, урогенитальных инфекциях. В отечественной литературе есть лишь единичные работы об использовании ПЦР для этологической расшифровки инфекционных диарей. Однако в этих работах приводится лишь статистическая оценка и эпидемиологические данные. Вопросы клинической интерпретации нового лабораторного метода обследования детей с ОКИ этими авторами не рассматриваются

При проведении ПЦР- исследования этиологию ОКИ удалось установить у 374 детей (70,8%), что более чем в 4 раза превышает процент этиологической расшифровки с использованием комплекса рутинных методов диагностики (Петрова, 2000).

Использование метода ПЦР для определения частоты обнаружения энтеровирусов у детей с серозным менингитом.

РНК энтеровирусов была выявлена из клинического материала у 48 из 72 детей (66,7 ± 5,5 %) с симптомами серозно-вирусного менингита или другими симптомами энтеровирусной инфекции через 24 часа после взятия проб для исследования. Наиболее часто энтеровирусы обнаруживали в мазках из носоглотки - 68,3 ± 6,0 %. При этом в первые 1-3 дня от начала болезни энтеровирусы в носоглотке определялись в 65,8 ± 7,4 % случаев, в последующие 4-7 дней частота выявления энтеровирусов не снизилась, а увеличилась до 75,0 ± 9,6 %. В то же время при исследовании ликвора в первые 3 дня болезни детекция энтеровирусов была самой высокой и составила 28,9 ± 7,3 %, а в последующие дни этот показатель снизился до 14,3 ± 7,6 %. В фекалиях, взятых для исследования спустя 4-7 дней от начала заболевания, % выявления энтеровирусов составил 42,9 ± 10,8 %. Спустя 3-4 месяца после перенесенной инфекции энтеровирусы в мазках из носоглотки определяли в 13,7 ± 6,3 % случаев. В группе сравнения - у 29 детей с бронхолегочными заболеваниями - РНК энтеровирусов в мазках из носоглотки и в фекалиях не выявили. Полученные результаты демонстрируют возможность экспресс-диагностики (в течение 24 часов) энтеровирусной инфекции с помощью использования ОТ-ПЦР. Быстрая диагностика необходима для расшифровки спорадических случаев и эпидемических вспышек заболеваний, вызванных энтеровирусами, для контроля лечения заболевших (Резник, 2005).

Применение ПЦР- анализа при исследовании лептоспирозов.

Лептоспиры относятся к микроорганизмам с выраженным фенотипическим и генотипическим полиморфизмом. Известны случаи, когда даже единичные нуклеотидные замены в нуклеотидных последовательностях генов_мишеней у возбудителей приводят к нарушению процесса отжига праймеров и, в конечном итоге, к отрицательным результатам ПЦР. ПЦР- анализ дает хорошие результаты даже при лечении больных антибиотиками, и поэтому его можно использовать для контроля эффективности лечения больных. Соответственно, подтверждено, что результаты ПЦР всё же стоит учитывать в данных исследованиях в силу их высокой точности (Самсонова, 2004).

1.5 Применение ПЦР в ветеринарии

Особое место полимеразная цепная реакция заняла при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота. При массовых исследованиях поголовья на туберкулез применяется аллергическая диагностическая проба. Она основана на внутрикожном введении туберкулина (белковый субстрат, полученный при аутолизе микобактерий) и оценке возникающих реакций.

Внедрение ПЦР в схему диагностики туберкулеза крупного рогатого скота связано с тем, что ежегодно большое количество животных подвергаются вынужденному диагностическому убою. Фактически, по показаниям аллергической пробы, проходит убой здоровых животных. Как правило, на туберкулин реагируют высокопродуктивные животные и ущерб от вынужденного убоя достаточно высок. Аллергическая проба основана на реакции иммунных клеток на взаимодействие возбудителя или продуктов его распада. В организм животного вводится лиофилизированный белок (антиген) возбудителя, чтобы вызывать ответную реакцию организма на его введение, проявляющуюся клинически через некоторое время. Введение туберкулина вызывает возникновение кратковременной микобактеремии, обусловленной резким повышением сосудистой проницаемости вследствие выброса биологически активных веществ и активации имеющегося очага воспаления с образованием в нем микронекрозов (Корнева, 2002).

Сенсибилизированный организм животного представляет собой неустойчивый в реактивном отношении биологический комплекс, который легко может проявить повышенную чувствительность не только к тому веществу, который был сенсибилизирован, но и ко многим другим аллергенам. Туберкулин не является токсином, поэтому свойства реакции в основном зависят от состояния макроорганизма. На показания туберкулиновой пробы влияют многие факторы: возраст, упитанность, масть, наличие инфекционных и инвазионных болезней, авитаминоз, беременность и др (Черноусова, 2001).

Задачей ПЦР при диагностике туберкулеза является дифференциация истинных реакций на туберкулин от псевдоаллергических. Именно поэтому, выявленные ПЦР-положительные животные подлежат немедленной изоляции и диагностическому убою. Согласно дополнению к приказу № 5 Департамента Ветеринарии зону производственных испытаний тестсистем ПЦР с целью контроля за эпизоотической обстановкой по некоторым хроническим болезням животных в 2000-2002 гг. (приказ № 13-5-18 от 20.06.2000).

Применение ПЦР для идентификации и дифференциации вируса Блутанга.

Для синтеза кДНК используются наружные праймеры, фланкирующие продукт ПЦР размером 826 пар оснований. Амплификация с гнездовыми (внутренними) праймерами на нем дает продукт ПЦР размером 517 пар оснований, специфичный только для вируса блутанга (Корнева, 2002).

Проведенная ПЦР специфично обнаружила все серотипы вируса блутанга в исследуемых культуральных и мозговых образцах, что подтверждает, что участок генома кодирующий NS1 имеет консервативные последовательности.

Таким образом, полимеразная цепная реакция, в силу своей чувствительности и специфичности, является ценным методом для идентификации вируса блутанга в лизатах инфицированных клеток и пробах головного мозга мышей.

ПЦР- диагностика Лейкоза крупного рогатого скота .

Метод ПЦР-диагностики позволяет обнаружить наличие вируса в крови животных на более ранних стадиях инфекционного процесса, чем серологические тесты. Разработанный метод ПЦР-диагностики ВЛКРС-инфекции отличается высокой чувствительностью (для обнаружения ДНК-провируса достаточно 10 инфицированных клеток) относительно РИД. Использование метода ПЦР-диагностики в практике ветеринарии позволило бы выявлять ВЛКРС-инфекцию на самых ранних стадиях ее развития, что особенно важно при проведении оздоровительной работы в племенных хозяйствах, исследовании быков-производителей, а также на заключительных этапах оздоровления хозяйства (<#"center">полимеразная цепная реакция

Список литературы

1. Аристова, В.А. Тест-система для выявления РНК вируса Крымской-Конго Геморрагической лихорадки методом ОТ-ПЦР / В.А. Аристова, Колобухина, М.Ю. Щелканов, Д.К. Львов // Вопросы вирусологии. - 2001. - № 4. - С. 7-15.

. Корнева, И.Н. Диагностика туберкулеза крупного рогатого скота с применением полимеразной цепной реакции. Сборник тезисов четвёртой Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» / Корнева И.Н., Осипова Е.П., Найманов А.Х. // М. 2002. С. 343-344.

. Малкова, Е.М. Изучение роли вируса краснухи в формировании врождённых пороков развития методом РТ-ПЦР / Е.М. Малкова, И.П. Терещенко, О.Н. Гришаева, Г.И. Тюников, И.Я. Извекова, И.Д. петрова, В.С. Петров, М.П. Гришаев, Е.И. Краснова // Педиатрия. - 2002.- №1.- с. 36-40.

. Мухина, А.А. Диагностика ротавирусной инфекции методом полимеразной цепной реакции / А.А. Мухина // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2002.- №2. - с. 43-47.

. Петрова, И.Д. Выявление врождённых пороков развития / И.Д. Петрова // Аллергия, астма и клиническая иммунология. - 2000.- №10. - с. 20-23.

. Резник, В.И. Особенности эпидситуации энтеровирусных инфекций на Востоке России в 2003-2004гг. / В.И. Резник, М.А. Перескокова, В.А. Шмелева // Дальневосточный журнал инф. патологии. -2005. - №7. - С. 25-32.

. Самсонова, А.П. Геномный полиморфизм патогенных лептоспир и проблемы ПЦР-диагностики лептоспирозов / А.П. Самсонова, Е.М. Петров, В.В. Лебедев // Клиническая лабораторная диагностика. - 2004. - № 9. - С. 30.

. Сборник санитарных и ветеринарных правил. 10. Туберкулез. СП 3.1.093-96, ВП 13.3.1325-96-1996. С. 157-172.

. Черноусова, Л.Н. Роль ПЦР-анализа в комплексных бактериологических исследованиях во фтизиатрии / Л.Н. Черноусова, Е.Е. Ларионова, Э.В. Севастьянова // Проблемы туберкулеза. 2001. № 3. С. 58-60.

10. <http://www.pcr.ru/bibliogr/articles/article_18.htm>

. <http://www.medicinform.net/gyn/gyn_pop1.htm>

. <http://www.cmd-online.ru/help/articles/pcr>

. <http://policlinica.ru/analiz5_13.html>

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «КЕМЕРОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» Биологический факу

Больше работ по теме: