Анализ комплексов лактоферрина молока человека

 

Анализ комплексов лактоферрина молока человека

ВВЕДЕНИЕ

1.Обзор Литературы

1.1Строение и физико-химические свойства лактоферрина

1.1.1Строение молекулы лактоферрина

1.1.2Связывание ионов железа

1.1.3Олигомерные формы лактоферрина

1.1.4Взаимодействие лактоферрина с лигандами и его изоформы

2.Экспериментальная часть

2.1Теоретические основы использованных методов и аппаратурное обеспечение

2.1.1Методы рентгеновской и оптической дифракции

2.1.2Абляция

2.1.3Гель-хроматография

2.2Материалы и условия экспериментов

2.2.1Использованные реактивы и материалы

2.2.2Подготовка образцов лактоферрина для анализа

2.2.3Условия проведения гель-хроматографии белков

2.2.4Условия проведения экспериментов по анализу ЛФ методом малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР)

2.2.5Измерение индикатрис светорассеяния

2.2.6Условия проведения экспериментов по анализу ЛФ методом абляции

3.Результаты

3.1.Анализ олигомерных форм ЛФ методом гель-хроматографии

.2.Анализ олигомеров ЛФ методом светорассеяния

.3.Анализ олигомеров ЛФ методом абляции

.4.Обсуждение результатов

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Список литературы

ВВЕДЕНИЕ

Небольшой по молекулярной массе (76-80 кДа) белок лактоферрин (ЛФ) содержится в высокой концентрации в молозиве и молоке млекопитающих (от 1 до 7 мг/мл), а также является мажорным белком всех известных барьерных жидкостей, таких как слеза, слюна, секреты носовых желез, плазма крови и т.д. [1].

Известно, что ЛФ является белком острой фазы и неспецифической защиты человека от различного рода поражений [3, 4]. Появление очагов поражения приводит к активации синтеза ЛФ и повышению его концентрации в эпителиальных секретах и барьерных жидкостях человека, а также непосредственно в очаге поражения.

Лактоферрин является едва ли не единственным примером белка с исключительно уникальным набором биологических свойств различного характера. Будучи представителем семейства трансферриновых белков, он не только регулирует концентрацию ионов железа в крови и секретах, но и обладает ярко выраженным антимикробным действием вследствие конкуренции с мембранными рецепторами бактерий за атомы железа. Кроме того, он регулирует процессы воспаления. Одним из способов регуляции процессов воспаления считается способность ЛФ связываться с липополисахаридными составляющими стенки бактериальных клеток, которые являются основными медиаторами воспаления при бактериальных инфекциях. Апо-ЛФ, связывая свободные ионы железа в очаге воспаления, ингибирует образование гидроксильных радикалов из перекиси водорода и О¯2 , проявляя свойство антиокислительного агента. ЛФ обладает выраженными антивирусным и антипаразитарным действием.

Благодаря перечисленным выше и ряду других свойств, лактоферрин считается одним из важнейших защитных факторов молока и барьерных жидкостей человека. Он участвует в защитных реакциях организма и регулирует функции иммунокомпетентных клеток, а так же ингибирует продукцию цитокинов. Одно из наиболее интересных свойств лактоферрина - это взаимодействие с полианионами: гепарином, ДНК и РНК. Обнаружена способность белка гидролизовать РНК и ДНК, а также наличие в молекуле белка структурных мотивов, подобных активному центру РНКазы А. Последние исследования показали, что лактоферрин легко проходит через внешнюю и ядерную мембраны клеток, проникает в ядра клеток, связывается со специфическими последовательностями ДНК и активирует процессы транскрипции. Строгая видовая и, в то же время, широкая межорганная специфичность лактоферрина говорят о неоднозначности биологической роли белка в клетке. Благодаря своим разнообразным свойствам, лактоферрин в последнее время является объектом активных исследований.

Одним из возможных объяснений исключительной полифункциональности лактоферрина может быть его способность олигомеризоваться и образовывать комплексы с другими белками, а также ДНК, РНК, АТР и олиго- и полисахаридами, что может вести к изменению и расширению спектра его биологических функций.

Целью данной работы было исследование образования олигомерных форм лактоферрина в нейтральном буфере в присутствии и отсутствии солей, а также влияния природных лигандов белка (АТР, АМР и олигосахарида) на процессы его олигомеризации. Для исследования олигомерных форм лактоферрина в работе использовано четыре метода: гель-хроматография, светорассеяние (CP), малоугловое рассеяние рентгеновских лучей (МУРР), а так же впервые сделана попытка использования для исследования олигомеров субмиллиметровой лазерной абляции. Такой набор методов позволяет оценить долю олигомеров любого размера, проследить кинетику образования олигомеров, а так же выделять отдельные олигомерные формы.

1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1Строение и физико-химические свойства лактоферрина

1.1.1Строение молекулы лактоферрина

Белки семейства трансферринов, которые содержатся в крови, контролируют уровень железа у высших животных путем прочного, но обратимого связывания ионов железа []. Лактоферрин (ЛФ) является одним из белков этого семейства, он был впервые открыт в женском молоке в конце 30-х годов. В дальнейшем изучению его строения и физиологической роли было посвящено значительное число исследований, которые показали, что ЛФ содержится в плазме крови, нейтрофильных лейкоцитах и является одним из основных белков практически всех экзокринных секретов млекопитающих []. В наибольшей концентрации ЛФ содержится в молозиве человека (до 6 - 7 мг/мл), в процессе лактации этот показатель в молоке уменьшается до 1 мг/мл (Табл. 1) [].

Таблица 1. Уровень ЛФ в различных жидкостях и тканях человека в норме*.

Жидкости и тканиКонцентрация ЛФМолозиво5 - 7 мг/млПромежуточное молоко3 - 4 мг/млМатеринское молоко1 - 3 мг/млОколоплодная жидкость2 - 32 мкг/млДецидуальная оболочка матки9 - 95 мкг/г белкаАмнион2 - 37 мкг/г белкаХорион2 - 26 мкг/г белкаТрофобласт5 - 35 мкг/г белкаПуповина<1 мкг/г белкаБронхиальная слизь35 мкг/млСлезная жидкость2 - 3 мг/млСлюна4 - 20 мкг/млВагинальная слизь4 - 200 мкг/мг белкаСеменная жидкость0,1 - 0.2 мг/млСиновиальная жидкость35 - 46 мкг/млСпинномозговая жидкость10 - 12 мкг/мл**Кровь0,1 - 1,6 мкг/млВенозная плазма0,12 мкг/млКапиллярная плазма0,1 мкг/млПлазма при сепсисе200 мкг/млЭмбриональная сыворотка0,05 мкг/млПлазма новорожденного0,27 мкг/млНейтрофилы крови взрослого человека1,2 - 15 мкг/106 нейтрофиловНейтрофилы крови новорожденного12 - 30 мкг/107 нейтрофилов*Концентрация белка в некоторых жидкостях, таких как амнион, слюна, синовиальная жидкость в случае инфекции увеличивается в 2-10 раз [].

**при бактериальных менингитах, в нормальном состоянии ЛФ не детектируется

ЛФ представляет собой гликопротеид с мол. массой 76 000 - 80 000 дальтон [1-3]. Белок существует в двух формах - железонасыщенной (холо-ЛФ, 80 кДа) и железоненасыщенной (апо-ЛФ, 75 - 76,4 кДа). По аминокислотному составу и мол. массе он сходен с трансферрином (73,8 - 86 и 75 - 76,6 кДа холо- и апо -формы, соответственно). Аминокислотные составы ЛФ и трансферрина имеют 59% и 49% гомологии между двумя соответствующими доменами, входящими в состав этих белков []. Вторичные и третичные структуры этих двух белков также сходны между собой. ЛФ отличается от трансферрина антигенной структурой, углеводными компонентами, изоэлектрической точкой, растворимостью в воде и расположением железосвязыващих участков и сайтов гликозилирования этих белков.

ЛФ образован одной полипептидной цепью, которая содержит 703 аминокислотных остатка. На основании данных рентгеноструктурного анализа с разрешением 2.0 Å была предложена модель трехмерной структуры ЛФ, согласно которой полипептидная цепь свернута в два гомологичных домена, называемых N- и C-долями, содержащими 1-338 и 339-703 остатки соответственно, а их концы соединены короткой a-спиралью (рис. 1). Каждая доля белка состоит из двух доменов: N1, N2 и C1, C2. Третичные структуры железонасыщенного и железоненасыщенного ЛФ различны; для апо-ЛФ характерна "открытая" конформация N-доли и "закрытая" конформация С-доли, а для Fe-ЛФ характерна закрытая конформация обеих долей (рис. 1) []. Между N- и C-долями наблюдается значительная степень гомологии: они имеют 125 одинаковых аминокислотных остатков, что составляет 37% гомологии [5].

Это привело к возникновению теории о копировании генов, когда 500 миллионов лет назад первоначальная молекула массой 40 кДа удвоилась и сформировала два гомологичных домена с молекулярной массой около 80 кДа [3]. Предполагают также, что ЛФ возник в процессе эволюции позже трансферрина.

Рис. 1. Структура апо-лактоферрина (железоненасыщенная форма) и Fe-ЛФ (железонасыщенная форма). Красным цветом показан сайт связывания полианионов - гепарина, липополисахаридов и хондриотинсульфата.

Углеводный компонент молекулы белка состоит из остатков сиаловой кислоты, фукозы, гексозы и N-ацетилглюкозоамина, которые образуют связи с остатками аспарагина 137 и 478 белковой части ЛФ []. ЛФ содержит два сайта гликозилирования по одному на N2 и C2 доменах, но степень гликозилирования белка может быть различной []. Именно поэтому мол. масса белка варьирует в диапазоне 76-80 кДа. Показано, что первичная структура гликозидных остатков ЛФ плазмы крови идентична углеводному компоненту ЛФ молока, за исключением двух остатков сахаров, связанных с белком N-гликозидной связью. Функция этих углеводных остатков точно не определена, однако их удаление не влияет на такие функции ЛФ, как связывание рецепторов [3]. ЛФ демонстрирует поразительную устойчивость к действию трипсина и трипсин - подобных протеаз, что обеспечивает сохранение целостности молекул белка в желудке. Было показано, что устойчивость ЛФ к деградации протеазами и при низких значениях рН обусловлена высокой степенью гликозилирования белка [3, ]. Железонасыщенная форма ЛФ более устойчива к протеолизу, чем апо-форма белка [3]. ЛФ относится к щелочным белкам, значение его изоэлектрической точки составляет 8,7 [].

1.1.2Связывание ионов железа

Каждая молекула белка может обратимо связывать два иона трехвалентного железа или ионы цинка, меди, магния и других металлов [3]. Причем центры связывания в каждой из двух белковых глобул, входящих в молекулу ЛФ, локализованы ближе к междоменной щели. В этих центрах железо координационно связано с двумя остатками тирозина, одним гистидином и одним остатком аспарагиновой кислоты []. Показано, что ЛФ участвует не только в транспорте ионов железа, цинка и меди, но и в регуляции их всасывания []. Наличие непрочно связанных ионов цинка и меди не влияет на железосвязывающую функцию ЛФ, а фактически даже усиливает ее. ЛФ образует с железом комплекс красноватого цвета. Одновременно с фиксацией ионов металла в железосвязывающем центре белка происходит фиксация аниона, в физиологических условиях это карбонат или бикарбонат ион, который с помощью электростатических взаимодействий связан с остатком аргинина. Присутствие аниона необходимо для прочного связывания железа с ЛФ, так как он нейтрализует положительный заряд катиона металла [3].

Сродство ЛФ к железу (Кd ~ 10-24 M) в ~300 раз выше, чем сродство трансферрина []. Кроме того, показано, что в слабокислой среде сродство ЛФ к железу повышается, что и облегчает переход металла с трансферрина на ЛФ при воспалительных процессах, когда рН тканей снижается за счет накопления молочной и других кислот []. Степень насыщения железом нативного ЛФ в женском молоке составляет по оценкам разных авторов от 10 до 30% [13, 14].

1.1.3Олигомерные формы лактоферрина

Как в плазме крови, так и в секреторных жидкостях ЛФ может существовать в виде различных олимерных форм от мономера, до тетрамера. Показано [14], что белок обнаруживает резко выраженную тенденцию к полимеризации in vitro и in vivo, и при высоких концентрациях преобладают олигомерные формы ЛФ. Кроме того, с помощью метода гель-хроматографии рядом авторов было обнаружено, что доминирующей формой ЛФ в физиологических условиях является тетрамер [, , ]; соотношение мономер: тетрамер при концентрации белка 10-5 М составляет 1 : 4. Авторы работ [15, 16] также предположили, что олигомерное состояние ЛФ определяется концентрацией данного белка в среде. Кроме того, по их мнению, полимеризация ЛФ строго зависела от присутствия ионов Ca2+. В присутствии ионов кальция и при концентрации белка менее 10-10 - 10-11 M авторы наблюдали преобладание мономерной формы белка. При концентрациях ЛФ более 10-9 - 10-10 M происходил переход в тетрамерную форму. Интересно отметить, что титр ЛФ в крови соответствует величине именно этой "переходной концентрации", и, таким образом, ЛФ в крови должен быть представлен как в виде мономера, так и тетрамера. Причем авторы не принимали во внимание существование прочих (димерных и тримерных) форм белка. Эти же исследователи обнаружили, что ряд функциональных свойств ЛФ определяется его олигомерным состоянием. Так, ЛФ в виде мономера способен к прочному связыванию с ДНК и регуляции процессов гранулопоэза, а тетрамерная форма не связывает ДНК [15, 16].

Авторами работы [] при определении олигомерного состояния ЛФ методом гель-хроматографии обнаружена только мономерная форма белка при нанесении на колонку 1 мг белка и около 10 % тетрамерной формы при нанесении 4 мг ЛФ. Причем тетрамер присутствовал только при анализе железонасыщенной фракции белка. Кроме того, SDS-электрофорез в восстанавливающих условиях показал, что только 30 % тетрамерной формы переходит в мономер, что, по их мнению, говорит о ковалентных межмолекулярных связях, формирующихся в процессе полимеризации. Тем не менее, природа межсубъединичных связей олигомера ЛФ до настоящего времени не выяснена, а ковалентных связей между мономерами ЛФ не обнаружено.

Следует отметить, что в рассмотренных выше (и ниже) работах для анализа олигомерного состояния ЛФ авторы использовали метод гель-хроматографии и различные сорбенты полисахаридной природы. Интересно, что ЛФ эффективно взаимодействует с такими носителями и эффективность взаимодействия различных олигимерных форм может существенно зависеть как от их олигомерного состояния, так и конформации различных форм ЛФ [19]. В следствие этого, место выхода олигомерных форм ЛФ при гель-хроматографии может не соответствовать их истинным мол. массам. Так, например, в работе [] было показано, что в отсутствии соли в высокой концентрации (1 М) ЛФ может "залипать" на таких носителях как Sephadex и элюироваться с колонки за времена, соответствующие высокоолигомерному состоянию. Добавление АТР к ЛФ привело к смещению пика белка при гель-хроматографии в место выхода между мономерной и димерной формами белка [19]. Было сделано предположение, что взаимодействие ЛФ с АТР приводит к диссоциации его олигомерных форм. Однако, как будет показано ниже, ЛФ связывается не только с АТР, но и различными полисахаридами, включая сорбенты, используемые при гель-хроматографии. Поэтому нельзя исключать, что обнаруженный эффект АТР может быть связан с уменьшением сродства ЛФ к полисахаридным матрицам под действием АТР, что приводит к уменьшению времени выхода ЛФ с сорбента и ошибочным заключениям об его олигомерном состоянии.

Кроме того, большинство исследователей не принимают во внимание олигомерную организацию белка, рассматривая его a priori как мономер с молекулярной массой 76 кДа. Есть все основания полагать, что в организации олигомерного состояния белка участвуют слабые нековалентные взаимодействия - преимущественно гидрофобные и электростатические контакты боковых групп остатков аминокислот молекулы ЛФ и, возможно, гликозидных остатков белка.

1.1.4Взаимодействие лактоферрина с лигандами и его изоформы

Одним из фундаментальных свойств ЛФ является его способность связывать полианионы типа гепарина, ДНК и РНК. Показано, что взаимодействие ЛФ с гепарином и другими полианионами имеет электростатическую природу []. Ф. Фурманским и соавторами [] было установлено, что связывание белка с ДНК может иметь специфический характер, они обнаружили три специфические последовательности ДНК, к которым белок проявляет повышенное сродство: GGCACTT(G/A)C, TAGA(A/G)GATCAAA и ACTACAGTCTACA.

Недавние исследования показали, что в случае специфических последовательностей ДНК, ЛФ обладает двумя сайтами связывания []. Один из них является высокоаффинным (Kd = 8.0·10-9 М), второй сайт связывает ДНК с гораздо меньшим сродством (Kd ~ 1.0·10-3 М). Показано, что высокоаффинный сайт локализован в N-концевой части молекулы белка, аналогично полианион-связывающему сайту ЛФ и антибактериальному домену. Взаимодействие ЛФ с гепарином и тРНК ингибировало связывание ДНК с белком. Это свидетельствует о том, что ДНК-связывающий сайт совпадает или частично перекрывается с полианион-связывающим сайтом и антибактериальным доменом ЛФ [22].

В работах [19, , ] было показано, что ЛФ взаимодействует с АТР и другими нуклеотидами. С помощью метода аффинной модификации было установлено, что АТР связывающий центр ЛФ локализован в С-концевой части белковой молекулы [19].

Ф. Фурманским и соавторами [, ] было показано, что ЛФ как гранулоцитов, так и молока человека представлен тремя изоформами, которые проявляют различное сродство к сорбенту Blue Sepharose и могут быть эффективно разделены с помощью этого сорбента. Причем только одна из изоформ (ЛФ-a), в отличие от двух других, способна связывать ионы железа. Все три изоформы белка проявляют сходные физические, химические и антигенные характеристики (молекулярная масса, изоэлектрическая точка, устойчивость к протеолитическому расщеплению). Однако оказалось, что две изоформы, не связывающие ионы железа (ЛФ-? и ЛФ-?), обладают РНК-гидролизующей активностью.

В ряде работ [, , ] хроматография ЛФ на Blue Sepharose была использована для анализа возможности наличия у белка каталитически активных изоформ белка с другими каталитическими активностями. При хроматографии ЛФ на Blue Sepharose достигнуто разделение белка на несколько отдельных субфракций с разным сродством к сорбенту, в результате которого происходит отделение от основного пика белка нескольких дополнительных пиков ЛФ. Все пики белка были исследованы в реакции расщепления ряда различных субстратов и показано, что кроме гидролиза РНК различные изоформы ЛФ активны а гидролизе ДНК (ДНКазаная), АТР (АТРазная), олиго- и полисахаридов (амилолитическая), а также отщеплении 5-концевого фосфотной группы олигонуклеотидов (5-фосфатазная активность). Положение пиков различных активностей на профиле хроматографии в основном не совпадало, но некоторые пики ЛФ обладали несколькими ферментативными активностями. Субстратная специфичность ЛФ в гидролизе ДНК отличается от таковой для известных ДНКаз человека [28]. В отличие от основной фракции ЛФ с самым высоким сродством к Blue Sepharose, все субфракции ЛФ с ДНКазной активностью оказались цитотоксичными и подавляли рост клеток раковых линий мышей и человека.

Возможные причины различия свойств этих изоформ пока не установлены. Авторы работ [27-29] предположили, что наличие изоформ может быть обусловлено различной степенью гликозилирования белка и/или его фосфорилирования. Тем не менее, эта гипотеза пока не проверена экспериментально.

Как следует из рассмотренных выше данных, в организме человека могут присутствовать изобелковые формы ЛФ [25-29]. Принимая во внимание эти данные, а также возможность существования ЛФ в как минимум четырех различных олигомерных состояниях (мономер - тетрамер) очевидно, что образование различных олигомерных форм белка, состоящих из субъединиц, соответствующих различным избелковым формам, является одним их потенциальных путей модификации свойств лактоферрина.

Дополнительным путем регуляции-изменения биологических свойств ЛФ может быть его взаимодействие с большим числом биологически активных молекул: РНК, ДНК, АТР, белками или лигандами полисахаридной природы.

Молекула ЛФ обладает исключительной конформационной лабильностью и может существовать в самых разных конформационных состояних. Это связано с тем, что в молекуле белка два домена соединены с помощью достаточно гибкого аминокислотного фрагмента. Это создает дополнительные возможности различного рода изменений конформации белка в отсутствии и в присутствии природных лигандов и, как следствие, самым разным изменениям его биологических свойств. Таким образом, следует полагать, что в регуляции свойств ЛФ человека может быть задействовано несколько совершенно различных механизмов, которые включают: а) аллостерическое изменение конформации белка под действием ионов железа и других металлов, а также нуклеиновых кислот, белков, нуклеотидов или полисахаридов, б) изменение олигомерного состояния белка под действием указанных природных лигандов, в) существование мономеров белка в виде большого числа различных изобелковых форм, а также образования олигомерных форм белка, состоящих из различных субъединиц, соответствующих этим формам.

Таким образом, очевидно, что несмотря на более, чем 50-летнюю историю исследования механизмов функционирования ЛФ, изучение этого белка представляется исключительно актуальным и в настоящее время. Современные достижения в области развития новых физико-химических методов исследования белков представляются исключительно перспективными для анализа закономерностей возможности олигомеризации ЛФ под действием различных лигандов.

2.Экспериментальная часть

2.1Теоретические основы использованных методов и аппаратурное обеспечение

2.1.1Методы рентгеновской и оптической дифракции

2.1.1.1Рассеяние плоской волны веществом

Пусть плоская монохроматическая волна A0exp(ik0r) падает на рассеивающий центр О, который под действием излучения становится источником сферической волны (рис. 2). Тогда в точке наблюдения L, результирующая волна имеет вид.

(2.1)

Здесь k0 и k - волновые векторы падающей и рассеянной волн, |k0| = |k|= 2?/?, ? - длина волны, А0 и А0b/|r| - амплитуды этих волн, r - вектор, соединяющий точку L с рассеивающим центром в точке О. Амплитуда рассеянной сферической волны равна произведению амплитуды падающей волны и коэффициента b/|r|, где значение b определяется видом падающего излучения и природой рассеивающего центра, находящегося в точке О. Чем сильнее взаимодействие падающей волны с центром О, тем больше коэффициент b. Он имеет размерность длины и носит название длины рассеяния, или амплитуды рассеяния точечного центра. Рассеяние плоской монохроматической волны на реальных объектах, состоящих из совокупности ядер и электронов, можно рассматривать как точечные рассеивающие центры.

Рассеивающую способность произвольного скопления ядер, электронов при облучении их рентгеновскими лучами или светом можно характеризовать рассеивающей плотностью ?(r) - скалярным полем, заданным в ограниченной области пространства. Для рентгеновского рассеяния ?(r) - плотность распределения заряда, в случае света - это оптическая плотность вещества, зависящая от показателя преломления. Взаимодействие волны (рентгеновского излучения или света) с веществом можно представить себе таким образом, что волна электромагнитного излучения взаимодействует со всеми ядрами, электронами и валентными оболочками, которые становятся источниками сферических волн.

Рис. 2 Рассеяние плоской волны точечным центром (а) и ограниченной областью, задаваемой потенциалом ?(r') (б).

Суперпозиция этих волн представляет собой первое приближение к реальному рассеянию. Можно показать, что функция

(2.2)

является амплитудой упругого рассеяния на скалярном поле ?(r). Это - так называемое первое борновское приближение, иными словами - приближение однократного рассеяния.

Выражение (2.2) представляет собой интеграл Фурье, т.е. разложение функции f(h) по базисной системе ортогональных функций - экспоненциальных функций exp(ihr). Решение обратной задачи - нахождения ?(r) при известной функции f(h)-дается обратным преобразованием

(2.3)

Таким образом, преобразования Фурье лежат в основе расчетов амплитуд рассеяния по заданной системе рассеивающих центров и плотности поля рассеяния по заданной амплитуде рассеяния, если, разумеется, выполнены условия первого борновского приближения. При определении атомной и молекулярной структуры вещества, экспериментаторы стараются всегда так поставить эксперимент, чтобы это приближение (и тем самым взаимные интегральные фурье-преобразования (2.2) и (2.3) для амплитуды и плотности рассеяния) выполнялось. Экспериментально определяется не сама амплитуда рассеяния, а интенсивность I(h), пропорциональная квадрату амплитуды рассеяния:

(2.4)

? - телесный угол). Функция I(s) называется интенсивностью рассеяния (название, принятое в рентгеноструктурном анализе и в светорассеянии). Видно, что размерность этой функции - квадрат длины. Важной характеристикой объекта является полная интенсивность (или полное сечение) рассеяния, которая дается интегрированием (2.4) по всем углам:

(2.5)

Главной задачей структурного анализа вещества является восстановление распределения рассеивающей плотности ?(r) по измеренной функции I(h).

2.1.1.2Формула Гинье. Угловое разрешение

С точностью до h4 имеем разложение интенсивности I(h) в близи точки h = 0:

(2.6)

Выражение в скобках в правой части (2.6) можно рассматривать как первые два члена разложения в ряд Маклорена функции ехр(-h2R2g/3). Поэтому с точностью до членов, пропорциональных h4, для начальной части кривой рассеяния можно записать

(2.7)

Это - так называемая формула Гинье, выведенная им еще в 1939 г. Для установления связи параметров I(0) и Rg со строением частицы подставим разложение:

sin(hr)/hr = 1 - h2r2/6 + h4r4/120 - h6r6/5040 + ...

в формулу Дебая:

(2.8)

Поместив начало координат в центре массы частицы, можно получить выражение:

(2.9)

Это - известное выражение для радиуса инерции частицы относительно ее центра массы.

Таким образом, начальная часть кривой рассеяния вне зависимости от конкретного строения частицы описывается с помощью двух параметров: I(0), который характеризует общее количество рассеивающей материи, и Rg, который несет информацию о ее распределении относительно центра массы частицы.

Цель дифракционного эксперимента - это измерение интенсивности рассеяния I(h) при определенных величинах модуля вектора рассеяния h = 4 ? ? ? n ? (sin ?)/?, где n - показатель преломления окружающей частицу среды. Для исследования структуры частиц или вообще каких-либо неоднородностей плотности определенного масштаба нужно иметь возможность вести измерения рассеянного излучения в определенном интервале значений шкалы h, А-1. Для дисперсных систем с более крупными размерами частиц надо использовать меньшие значения h и наоборот. Поэтому измерения рассеянного излучения необходимо проводить при таких углах рассеяния 2?, при которых реально используемые длины волн (?) излучения не могут существенно превышать межплоскостные расстояния: для рентгеновского излучения это 1 ÷ 2 А.

Формирование весьма узкого пучка первичного излучения, падающего на образец, достигается коллимационной системой первичного монохроматического пучка (рис. 3).

Рис. 3. Схема формирования первичного и рассеянного излучения при малых углах рассеяния в прямом (а) и обратном (б) пространствах: 1 - источник излучения; 2, 3, 4 - круглые отверстия коллиматора; 5 - образец; 6 - плоскость приемника излучения.

Система двух круговых диафрагм малого размера, разнесенных на большое расстояние (по сравнению с размером отверстий), позволяет приблизиться к условиям плоской волны. Величина проекции первичного пучка в плоскости приемника, а в сочетании с выбранным расстоянием от образца до детектора и тот наименьший угол 2?min (соответственно hmin), начиная с которого ведутся измерения интенсивности рассеянного излучения, и определяют разрешение конкретной коллимационной системы. Таким образом, верхний предел размеров неоднородностей, которые могут быть исследованы на данных установках (дифрактометрах), определяется углом 2?min, а нижний предел разрешения всегда соответствует величине 2? = 180о.

2.1.2Абляция

Для абляции лиофилизованных препаратов белков и их комплексов использовалось излучение ЛСЭ на длине волны 130 мкм, после чего дисперсный состав анализировался с помощью Диффузионного спектрометра аэрозолей.

2.1.2.1Лазер на свободных электронах

ЛСЭ Сибирского Центра Фотохимических Исследований является самым мощным в мире источником в диапазоне длин волн 120-200 микрон. Он дает излучение со средней мощностью до 400 Вт.

Принцип действия ЛСЭ основан на том, что движущаяся заряженная частица (ДЗЧ) в знакопеременном магнитном поле приводится в колебательное движение поперек направления своего движения. При этом возникает излучение в малом телесном угле вперед по направлению движения ДЗЧ. Это излучение зависит от продольной скорости ДЗЧ, и шага ондулятора. Основные параметры ЛСЭ приведены в табл. 2.

Таблица 2 Основные параметры ЛСЭ.

Энергия электронного пучка, МэВ 12 Частота ВЧ-системы, МГц 180,4 Частота следования сгустков, МГц 11,75 Средний ток, мА 20 Максимальная средняя выводимая мощность лазерного излучения, Вт 400 Диапазон перестройки длин волн, мкм 120-235 Ширина спектра излучения ??/?, (минимальная) 3?10-3 Эффективность рекуперации, % >95 Длина волны основной гармоники(120 … 235) мкмОбласть спектра 2-й и 3-й гармоник(40 … 117) мкмОтносительная спектральная ширина(0.3 … 1) % Диаметр гауссова пучка на выходе beamline 80 ммСтепень поляризации излучения>99.6 % Поперечная когерентностьПолная Временная когерентность(40 … 100) псМаксимальная средняя мощность, 0.4 кВт (11.2 МГц) Длительность импульса(40 … 100) псЧастота повторения(2.8 … 11.2) МГц

2.1.2.2Диффузионный Спектрометр Аэрозолей

Для определения дисперсного состава продуктов абляции использовался Диффузионный спектрометр аэрозолей, разработанный в ИХКГ СО РАН.

Принцип действия ДСА основывается на зависимости диффузионного коэффициента микрочастиц от их размера. Аэрозоль пропускается через серию сеток, на каждой из которых часть частиц улавливается. Частицы, обладающие меньшими размерами, улавливаются в первую очередь. В случае диффузионной батареи сетчатого типа, зависимость коэффициента прохождения от размера частиц будет иметь следующий вид:

(2.10)

Здесь B - величина зависящая от конструкции сеток, n - номер сетки.

Таким образом, в случае полидисперсного аэрозоля имеющего плотность распределения и концентрацию N0, на выходе диффузионной батареи, согласно (2.10), будем иметь концентрацию N(n) :

(2.11)

Рис. 4. Схема ДСА. 1 - диффузионная батарея, 2 - КУСТ, 3 - счетчик частиц

Отсюда видно, что задача об определении дисперсного состава и концентрации аэрозоля с помощью ДСА сводится к измерению N(n) и последующему решению интегрального уравнения (2.11)

Для каждой сетки существует канал, по которому происходит отбор части частиц на конденсационный укрупнитель, откуда они поступают на счетчик частиц для определения их количества. По получаемому распределению количества аэрозольных частиц в зависимости от номера канала оценивается их размер. Основные параметры ДСА приведены в табл. 3.

Таблица 3 Основные параметры ДСА.

Диапазон измеряемого размера частиц0.003-0.2 мкмМаксимальная измеряемая концентрация частиц 5 × 105 см -3Время одного измерения4 минуты

Точность оценки моментов распределения составляет 10%. Проверка точности на примере йодистого и хлористого серебра показала 10% соответствие результатов ДСА и электронного микроскопа (табл. 4).

Таблица 4 Параметры распределения, найденные электронной микроскопией и с помощью диффузионной батареи.

Электронная микроскопияДиффузионная батареяВыборкаd50, нмsgd50, нмsg70024.01.5128.01.434033.41.5634.01.6550517.41.5218.01.4534020.41.7322.01.5552050.51.6751.01.6533641.51.6444.01.60

2.1.3Гель-хроматография

Эксклюзивная (гель-проникающая) хроматография представляет собой вариант жидкостной хроматографии, в котором разделение веществ происходит за счет распределения молекул между растворителем, находящимся в порах сорбента и растворителем, протекающим между его частицами.

Основные параметры хроматографического разделения.

Основными параметрами хроматографического разделения являются удерживаемый объем и время удерживания компонента смеси (рис. 5).

Время удерживания tR - это время, прошедшее от момента ввода пробы в колонку до выхода максимума соответствующего пика. Умножив время удерживания на объемную скорость элюента F , получим удерживаемый объем VR:

= tR . F;(2.13)

Исправленное время удерживания - время, прошедшее с момента появления максимума пика несорбируемого компонента до пика соответствующего соединения:

tR' = tR - t0;(2.13)

Приведенный или исправленный объем удерживания - это объем удерживания с поправкой на мертвый объем колонки V0, т. е. на объем удерживания несорбируемого компонента:

' = VR - V0;(2.14)

Характеристикой удерживания является также коэффициент емкости k', определяемый как отношение массы вещества в неподвижной фазе к массе вещества в подвижной фазе: k' = mн / mп. Величину k' легко определить по хроматограмме:

(2.15)

Рис. 5. Характерный вид хроматограммы

Важнейшими параметрами хроматографического разделения являются его эффективность и селективность.

Эффективность колонки, измеряемая высотой теоретических тарелок (ВЭТТ) и обратно пропорциональная их числу (N) тем выше, чем уже пик вещества, выходящего при том же времени удерживания. Значение эффективности может быть вычислено по хроматограмме по следующей формуле:

= 5.54 . (tR / )2,(2.16)

где tR - время удерживания, - ширина пика на половине высоты

Зная число теоретических тарелок, приходящееся на колонку, длину колонки L и средний диаметр зерна сорбента , легко получить значения высоты, эквивалентной теоретической тарелке (ВЭТТ), и приведенной высоты (ПВЭТТ):

ВЭТТ = L/N ПВЭТТ = ВЭТТ/dc(2.17)

Эти характеристики позволяют сравнивать эффективности колонок различных типов, оценивать качество сорбента и качество заполнения колонок.

Селективность разделения двух веществ определяется по уравнению:

,(2.18)

При рассмотрении разделения смеси двух компонентов важным параметром служит также степень разделения :

;(2.19)

Пики считаются разрешенными, если величина больше или равна 1.5.

Основные хроматографические параметры связывает следующее уравнение для разрешения:

;(2.20)

Факторами, определяющими селективность разделения, являются: 1) химическая природа сорбента; 2) состав растворителя и его модификаторов; 3) химическая структура и свойства компонентов разделяемой смеси; 4) температура колонки.

Аппаратура для жидкостной хроматографии.

В современной жидкостной хроматографии используют приборы различной степени сложности - от наиболее простых систем, до хроматографов высокого класса, снабженных различными дополнительными устройствами.

Рис. 6. Блок-схема жидкостного хроматографа.

На рис. 6 представлена блок-схема жидкостного хроматографа, содержащая минимально необходимый набор составных частей, в том или ином виде, присутствующих в любой хроматографической системе.

Насос (2) предназначен для создания постоянного потока растворителя. Его конструкция определяется, прежде всего, рабочим давлением в системе. Для работы в диапазоне 10-500 МПа используются насосы плунжерного (шприцевого), либо пистонного типов. Недостатком первых является необходимость периодических остановок для заполнения элюентом, а вторых - большая сложность конструкции и, как следствие, высокая цена. Для простых систем с невысокими рабочими давлениями 1-5 МПа с успехом применяют недорогие перистальтические насосы, но так как при этом трудно добиться постоянства давления и скорости потока, их использование ограничено препаративными задачами.

Инжектор (3) обеспечивает ввод пробы смеси разделяемых компонентов в колонку с достаточно высокой воспроизводимостью.

Колонки (4) для ВЭЖХ представляют собой толстостенные трубки из нержавеющей стали, способные выдержать высокое давление. Большую роль играет плотность и равномерность набивки колонки сорбентом. Для жидкостной хроматографии низкого давления с успехом используют толстостенные стеклянные колонки. Постоянство температуры обеспечивается термостатом (5).

Детекторы (6) для жидкостной хроматографии имеют проточную кювету, в которой происходит непрерывное измерение какого-либо свойства протекающего элюента. Наиболее популярными типами детекторов общего назначения являются рефрактометры, измеряющие показатель преломления, и спектрофотометрические детекторы, определяющие оптическую плотность растворителя на фиксированной длине волны (как правило, в ультрафиолетовой области). К достоинствам рефрактометров (и недостаткам спектрофотометров) следует отнести низкую чувствительность к типу определяемого соединения, которое может и не содержать хромофорных групп. С другой стороны, применение рефрактометров ограничено изократическими системами (с постоянным составом элюента), так что использование градиента растворителей в этом случае невозможно. Регистрирующая (7) система в простейшем случае состоит из дифференциального усилителя и самописца.

2.2Материалы и условия экспериментов

2.2.1Использованные реактивы и материалы

В работе были использованы следующие реактивы и материалы: Трис- (гидроксиметил)-аминометан, КCl, N,N'-метилентрисакриламид, додецилсульфат натрия, N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамин, персульфат аммония, АТР, АМР и мальтогептоза ("Sigma", США), человеческий сывороточный альбумин ("Reanal" Венгрия), маркеры молекулярной массы белков ("Sigma", США), другие реактивы - препараты отечественного производства квалификации ос.ч.

Препараты IgG, sIgA и IgM антител были любезно предоставлены сотрудниками ЛФР ИХБФМ СО РАН. Электрофоретически гомогенные препараты ЛФ из молока лактирующих женщин были получены Бабиной С. Е. (ИХБФМ СО РАН) согласно методикам описанным ранее [27, 28, 29].

2.2.2Подготовка образцов лактоферрина для анализа

После получения электрофоретически гомогенных препаратов лактоферрина их диализовали против 50 мМ Трис-НСl, рН 7.5, замораживали в жидком азоте и лиофилизовали на стандартной установке для лиофилизации при температуре - 3-4оС. Лиофилизованные препараты хранились практически без потери активности примерно в течение 1 года. В проведенных нами исследованиях использовались свежеполученные растворы лиофилизованных препаратов ЛФ (2 - 10 мг/мл) в 50 мМ Трис-НСl, рН 7,5. Сразу после растворения препаратов ЛФ их подвергали центрифугированию (5 мин, 10 тысяч оборотов/ мин) на центрифуге Eppendorf для удаления небольшого количества нерастворимого белка. Затем полученные растворы ЛФ (2-10 мг/мл ) инкубировали в 50 мМ Трис-НСl буфере, рН 7,5, без дополнительных компонентов или добавляли КСl (0,1 - 1 M), а также один из природных лигандов в насыщающих концентрациях: 50 мМ АТР, 50 мМ АМР или 5 мМ мальтогептозу. В зависимости от типа эксперимента смеси инкубировали при 25°С в течение 5 ч или нескольких суток (вплоть до 1 месяца) при 25° или 4° С. Аликвоты реакционных смесей использовали для анализа олигомерного состояния ЛФ с помощью четырех различных методов (см. ниже) сразу после их получения или после инкубации в течении различного времени.

2.2.3Условия проведения гель-хроматографии белков

Для анализа олигомерного состояния ЛФ после его инкубации в различных условиях использовали сорбент Sepharose 4B, который из всех проверенных смол для гель-хроматографии обладал минимальной способностью взаимодействавоть с ЛФ и его олигомерными комплексами. Хроматографию проводили с помощью хроматографа "Biocad Sprint", снабженного перестальтическим насосом с мягкой подачей раствора на колонку. Раствор ЛФ (0,2- 0,4 мл; 2-4 мг /мл) в в 50 мМ Трис-НСl буфере, рН 7,5, содержащем или несодержащем другие лиганды (до и после инкубации в различных условиях, см. выше) наносили на колонку Sepharose 4B (0,8 х 33 см), предварительно уравновешенную этим же буфером. Элюцию белков с сорбента проводили с помощью 50 мМ Трис-НСl буфера, рН 7,5, без соли или буфер содержал 0,1 или 0,15 М КСl. За выходом ЛФ следили по его поглощению на 280 нм. Для оценки мол. масс ЛФ и его комплексов с помощью метода гель-хроматографии использовали белки с известной мол. массой. Была получена калибровочная кривая, которая приведена ниже. Контрольные белки, как и ЛФ, наносили в объеме 0,1 - 0,3 мл в концентрации 1-3 мг/мл. Чувствительность детектора хроматографа равна 1×10-8 г/мл. Среднеквадратичное отклонение пиков при хроматографии препаратов ЛФ было найдено <2%. Минимальная характерная селективность разделения ближайших пиков ЛФ составила 1,3-1,4. Степень разделения варьировала от 0,3 до 2,5. Точность соответствия стандартам была оценена ? 6%.

2.2.4Условия проведения экспериментов по анализу ЛФ методом малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР)

Смеси (0.1 - 2 мл) для анализа содержали 50 мМ трис-HCl буфер, рН 7,5, 1-6 мг/мл (12-72 мкМ) ЛФ, в некоторые из них добавляли 0.1 - 1 М КСl. К реакционным смесям добавляли АМР, АТР или олигосахарид (0.1-5 мкл) в различных концентрациях, включая насыщающие: 50 мМ нуклеотиды и 5 мМ олигосахарид. В некоторых экспериментах в смесь были добавлены 3 M NaCl или 3 M MgC12 до конечной концентрации 1 М или 5 -25 мМ, соответственно. В МУРР и СР экспериментах использовали те же смеси, что и для гель-хроматографии. Измерения с помощью МУРР и СР и обработку полученных результатов проводили как описано выше.

2.2.5Измерение индикатрис светорассеяния

Прибор для измерения светорассеяния от анализируемых образцов (световой дифрактометр) состоял из одного фотодетектора и 14 лазерных монохроматических источников, установленных по внутреннему периметру камеры светорассеяния. В центр камеры помещали образец, а управление установкой и получение значений интенсивности производили при помощи компьютера. При этом поочередно включались лазерные источники и рассеянное излучение попадало в фотоприемник (детектор), после чего сигнал с приемника поступал на фотоэлектронный умножитель, откуда через аналоговый цифровой преобразователь передавался на компьютер. Индикатрисы светорассеяния измеряли в угловом диапазоне 2? = 56,25÷ 123,750 (h = 0.0018 ÷ 0.004 А-1), где h = 4 ? ? ? n ? sin(?)/?; n - показатель преломления буферной смеси (~1,35). Длина волны используемого светового излучения ? = 4300 А, применима к исследованию частиц 0,005 - 50 мкм, температура образцов при измерении индикатрис 200С. В индикатрисы вносили поправки на фоновое рассеяние и поглощение излучения образцом. Измерения проводились с точностью 3-5%, исходя из оценки точности , где N количество измерений. Чувствительность прибора составляет 10 импульсов/сек.

Калибровку прибора проводили для контроля влияния факторов, влияющих на точность измерений эффектов светорассеяния (состояние чистоты кюветы, аппаратные искажения и помехи). Для этого регулярно измерялись индикатрисы рассеяния (зависимости интенсивности рассеяния от угла) для стандартного образца (полистерин, диаметр частиц 2R = 0,2 мкм). Известно, что радиус инерции (Rg) и радиус (R) для однородной сферы связаны, как

.

Для всех полученных в работе экспериментальных данных был проведен математический и статистический анализ. Статистическую обработку результатов проводили методом вариационной статистики с применением t-критерия Стьюдента для средних арифметических (результаты считали достоверными при Р < 0,05).

2.2.6Условия проведения экспериментов по анализу ЛФ методом абляции

В экспериментах по абляции использовались те же растворы, что и в описанных выше исследованиях ЛФ методом гель-хроматографии, МУРР и СР. Различные образцы ЛФ (50-100 мкл) наносили в центр квадратов диаметром 1,5-2 см, полученных из силуфольных пластинок. Растворы белка наносили либо на поверхность, покрытую селикагелем, либо на обратную сторону - алюминиевую поверхность. Алюминиевые и силуфольные подложки перед нанесением образцов охлаждали жидким азотом и затем образцы подвергали лиофилизации на стандартной установке. Абляцию вели при интенсивности потока от 5 до 30 Ватт/см2. Анализ результатов абляции проводили, как описано выше.

3.Результаты

Как указано выше, ЛФ образует комплекс с АТР и другими рибо- и дезоксирибонуклеозид-5'- моно- ди и трифосфатами и гидролизует эти нуклеотиды [19, 23, 29]. Кроме того ЛФ взаимодействует с олиго- и полисахаридами и также гидролизует их [22-24, 27-26]. Согласно литературным данным ЛФ в растворе представлен преимущественно двумя формами - мономером и тетрамером [16]. Представлялось интересным исследовать не ведет ли комплексообразование ЛФ с его лигандами к изменению его олигомерного состояния и являются ли мономер и тетрамер действительно основными формами существования ЛФ в растворе или возможно образование промежуточных форм (димера и тримера), а также более высокоолигомерных форм, которые не возможно обнаружить с помощью использованных в литературе методов.

Для изучения олигомерных форм ЛФ необходимы были прямые методы анализа олигомерных форм белков в растворе. Известно, что использование дифракционных методов для анализа макромолекул и их комплексов позволяет получить информацию о их структуре и дисперсном составе непосредственно в растворе [, , ].

Для исследования олигомерного состояния ЛФ на первом этапе было использовано два подхода - метод малоуглового рассеяния рентгеновских лучей (МУРР) и светорассеяния (СР). Это определялось тем, что потенциально ЛФ мог находиться в различных олигомерных формах от мономера до высокополимерных состояний. В то же время, с помощью МУРР можно видеть только частицы относительно небольшого размера, характеризуемые параметром h = 0.013 ÷ 0.103 Å-1, что сопоставимо в размером олигомеров ЛФ, содержащих от 1 до 4 мономерных единиц, этот метод "не видит" более крупных частиц. Наличие в растворе более крупных частиц с h = 0,00137 ÷ 0.00206 Å-1 можно анализировать с помощью метода СР.

Обычно в экспериментах по исследованию ЛФ используются препараты белка, которые после очистки хранятся в нейтральных растворах с концентрацией порядка 2 - 10 мг/мл при 4oС или растворы белка замораживаются. Сначала нами были получены рентгенограммы МУРР для стандартного раствора лиофилизованного ЛФ (50 мМ Трис -НСl буфер, рН 7,5), хранившегося в течение месяца при 4оС (рис. 7).

Рис. 7. Рентгенограммы МУРР в координатах I(h) от h для одного из препаратов агрегированного ЛФ (68 мкМ) в 50 мМ Tрис-НCl буфере, рН 7.5, до и после инкубации с 1 M NaCl в течение 1 - 42 ч. Этим четырем кривым соответствуют значения Rg, равные: 43.7, 38.6, 32.9 и 27.4 Å, соответственно. Из данных МУРР следует что ЛФ переходит в мономерную форму при 1 М концентрации NaCl.

Данные для ЛФ были построены в координатах Гинье и на их основании рассчитано значение Rg. Согласно данным МУРР оно равно 43.7 Å, что значительно выше ожидаемого и свидетельствует в пользу того, что ЛФ находится в растворе не в моно, а в полидисперсном состоянии. Как известно, при добавлении 1 М NаСl олигомерные формы ЛФ должны диссоциировать до мономеров [16-17]. На рис. 7 приведены данные по изменению рентгенограмм МУРР во времени для раствора ЛФ после добавления NaCl до конечной концентрации 1 М. Из этих данных были оценены величины Rg для ЛФ через разные промежутки времени после добавления NаСl: 38.6 Å (через 1 ч); 32.9 Å (20 ч) и 27.4 Å, (42 ч). Как видно из рис. 7, кривая, соответствующие 42 ч инкубации совпадают с таковыми для ожидаемого мономера ЛФ с величиной Rg = 26.7 Å. Следовательно, диссоциация олигомерных форм ЛФ под действием соли происходит медленно, и только после 42 ч инкубации раствор содержит преимущественно мономерные формы белка.

Эти же растворы были проанализированы с помощью СР (подробнее смотри ниже). По данным СР растворы лиофилизованных препаратов ЛФ содержали олигомеры более высокой олигомеризации, чем тетрамеры, которые можно видеть с помощью МУРР.

Из данных полученных выше, было очевидным, что при длительном хранении растворов ЛФ происходит образование различных олигомерных форм белка. Для исследования эффектов различных лигандов на процессы олигомеризации необходимо было оценить временные интервалы, за которые происходит образование олигомеров в отсутствие и в присутствии различных лигандов ЛФ, а также КСl.

Как известно, ЛФ является исключительно конформационно активным белком [24]. Полученные данные свидетельствовали в пользу того, что в процессе лиофилизации молекулы белка могут переходить в какую-то конформацию, которая не способствует его олигомеризации с образованием форм с исключительно большой мол. массой. По-видимому, в процессе хранения растворов происходит медленное изменение конформации ЛФ и накопление таких мономеров, которые легко образуют его высокоолигомерные формы.

При помощи измерения светорассеяния на угол 900 была исследована кинетика олигомеризации ЛФ после добавления буфера, соли и лигандов (см. рис. 8).

Рис. 8. Относительное изменение светорассеяния на угол 90о при инкубации ЛФ в 50 мМ трис-НСl буфере от отсутствии (а) и в присутствии 0.1 М KCl (б). Реакционные смеси инкубировали в отсутствие других лигандов (кривые 1), в присутствии 50 мМ АТР (кривые 2) или 5 мМ олигосахарида (кривые 3).

Как видно из рис. 8а, в отсутствие КСl, происходит сильное увеличение СР раствора ЛФ в течение первых примерно 10 ч инкубации, а затем ее заметное уменьшение. При добавлении в инкубационную смесь АТР или олигосахарида процесс олигомеризации ЛФ замедляется; максимальные изменения СР наблюдаются после примерно 4-5 ч инкубации, а затем идет медленное возрастание СР.

Добавление 0,1 М КСl скорость начального процесса олигомеризации уменьшается, но после длительной инкубации достигается кажущегося плато значений СР, близкое к таковому для смеси без соли. Добавление АТР или олигосахарида в инкубационную смесь, содержащую 0,1 М КСl, приводит в большей степени к замедлению олигомеризации ЛФ в присутствии олигосахарида, чем АТР. Интересно, что как в отсутствие, так и в присутствии КСl после 100 ч инкубации раствора ЛФ с АТР значение СР выше, чем для растворов без АТ. Наклон кинетических кривых изменения интенсивности СР в присутствии АТР и олигосахарида свидетельствует в пользу того, инкубация смесей более 100 ч (~ 4 дней) может приводить к образованию большего количества олигомерных форм ЛФ в присутствии лигандов, чем в их отсутствии. Учитывая это, в описанных ниже экспериментах анализ содержания олигомерных форм ЛФ проводили после инкубации всех реакционных смесей более 10 дней.

3.1Анализ олигомерных форм ЛФ методом гель-хроматографии

Как отмечалось выше, ЛФ взаимодействует со многими широко распространенными сорбентами, используемыми для гель-хроматографии. Сотрудниками ЛФР ИХБФМ в результате анализа ряда сорбентов было показано, что наиболее оптимальным для анализа ЛФ c помощью метода гель-хроматографии является Sepharose 4B. Этот сорбент слабо взаимодействует с ЛФ и относительное время выхода олигомерных форм ЛФ при гель-хроматографии соответствует их относительным молекулярным массам. Учитывая это, в данной работе был проведен анализ относительного содержания олигомерных форм ЛФ, инкубированного в различных условиях, с помощью гель-хроматографии.

Для оценки относительной массы олигомерных форм ЛФ сначала была проведена гель-хроматография контрольных белков с известной мол. массой и построена калибровочная кривая (рис. 9).

Рис. 9. Калибровочная кривая для оценки мол. масс белков, полученная с использованием белков с известными мол. массами: ЧСА (67), IgG (150 кДа), IgA (400 кДа), IgM (800 кДа).

Следует отметить, что точное определение мол. масс небольших пиков белка около 800 кДа и более сильно затруднено, так как при таком малом времени выхода, значительными становятся такие факторы как ширина пика, а так же объем и время нанесения пробы на сорбент. Кроме того, Sepharose 4B обладает плохой эффективностью разделения белков с мол. массами ? 800 кДа. Учитывая это, далее следует считать, что фракции ЛФ, кажущиеся мол. массы которых оценены приблизительно как 780, 800 кДа и более (но не меньше) могут иметь и значительно большую мол. массу, или быть смесью нескольких субфракций белка, мол. масса которых превышает 780 кДа. В то же время пик декамера, соответствующий 754 кДа (см. ниже), скорее всего, можно считать определенным с более высокой точностью ввиду его малой ширины и хорошей высоты пика белка, а так же существенного удаления от характерного места выхода небольших по размеру пиков более 780 кДа.

На рис. 10 приведен профиль оптической плотности, соответствующей гель-хроматографии лактоферрина, инкубированного в 50 мM Трис-HCl, рН 7.5, а так же после инкубации ЛФ в этом же буфере, содержащем, 0,1 и 0,15 КСl. Видно, что ЛФ, инкубированному в буфере без соли, соответствует большой пик с кажущейся мол. массой 275 кДа с двумя плечами в области 295 и 251 кДа. Кроме того, видны пики в области ?145 кДа и относительно маленький по величине пик в области примерно 780 кДа.

Добавление к раствору ЛФ 0,1 М КСl ведет к очень сильному уменьшению пика с мол. массой 275 кДа и резкому увеличению пиков с мол. массами 145 и 68 кДа. Одновременно происходит уменьшение высокомолекулярного пика в области 780 кДа. Увеличение концентрации КСl до 0,15 М приводит к еще более сильному перераспределению относительного количества ЛФ в указанных пиках. После инкубации ЛФ с 1 М КСl обнаружен только один пик белка, элюируемый в области 68 кДа.

Рис. 10. Анализ олигомерных форм ЛФ с помощью гель-хроматографии. Приведены профили оптического поглощения при 280 нМ (А280) препаратов ЛФ, инкубированных в разных условиях. Перед гель-хроматографией ЛФ инкубировали в 50 мM Трис-HCl, рН 7.5 в отсутствие других лигандов (синяя кривая), в присутствии 0,1 M КСl (сиреневая кривая) или 0,15 M КСl (зеленая кривая).

При интерпретации полученных данных (рис. 10) следует принять во внимание следующие данные. Добавление КСl в инкубационную смесь, а также буфер, с помощью которого уравновешена колонка, должно приводить не только к диссоциации олигомерных форм ЛФ, но и уменьшению их взаимодействий с сорбентом. Кроме того, кажущиеся мол. массы белков при гель-хроматографии не всегда полностью соответствуют их истинным мол. массам, поскольку время выхода белков при гель-хроматографии зависит не только от мол. массы, но и от геометрической формы белковых глобул и их олигомеров. С учетом мол. массы мономера (76 -80 кДа), молекулярные массы олигомерных форм белка должны быть равными: быть 152 - 160 кДа (димер), 228-240 кДа (тример), 304-320 кДа (тетрамер). Если учесть, что мономер с мол. массой 76 -80 кДа демонстрирует кажущуюся мол. массу примерно 68-70 кДа, то приблизительные мол. массы олигомеров могут быть близкими: 136 -140 кДа (димер), 204 - 210 кДа (тример), 272 - 280 кДа (тетрамер). Реально наблюдаемые значения мол. масс димера (145 кДа ) и тетрамера (295-275 кДа) несколько ниже, чем вычисленные из значения истинной мол. массы мономера ЛФ, но в то же время немного больше, чем оцененные из значения кажущейся мол. массы мономера, найденной при гель-хроматографии. Особенно интересно, что пик при 275 кДа имеет два плеча при 295 и 251 кДа. По месту положения два из трех плохо разделенных пика могут соответствовать только тетрамерной форме ЛФ, в то время как третий пик с кажущейся мол. массой порядка 220 кДа может быть белковым тримером. Разделение тетрамерной формы белка на два пика может быть связано как с различной эффективностью взаимодействия различных тетрамерных форм ЛФ с сорбентом, так и возможностью различного типа укладки мономеров ЛФ при образовании тетрамера.

Как видно из рис. 11, согласно данным гель-хроматографии после инкубации ЛФ с олигосахаридом, белок в основном присутствует в растворе в виде мономера, димер проявляется в виде слабо выраженного плеча (150 кДа), небольшое количество ЛФ выходит в зоне тетрамера. Интересно, что добавление 0,15 М соли к раствору, содержащему олигосахарид, ведет к количественной димеризации белка, но уменьшению количества тетрамера.

В отсутствие соли, АТР лучше чем олигосахарид стимулирует образование димерной и тетрамерной форм ЛФ (рис. 12). Кроме того, становится заметным образование олигомера с мол. массой более 780 кДа. В то же время, в нейтральном буфере в присутствии АТР образование тетрамера происходит в существенно меньшей степени, чем в его отсутствии (рис. 10 и рис. 12). Добавление 0,1 М КСl приводит к замедлению процессов образования димера и тетрамера ЛФ. В то же время происходит явное увеличение доли крупного олигомера с массой более 780 кДа.

Рис. 11. Анализ олигомерных форм ЛФ с помощью гель-хроматографии. Приведены профили оптического поглощения при 280 нМ (А280) препаратов ЛФ, инкубированных в разных условиях. Перед гель-хроматографией ЛФ инкубировали в 50 мM Трис-HCl, рН 7.5, с олигосахаридом в отсутствие (синяя кривая) и в присутствии 0,15 M КСl (зеленая кривая).

Рис. 12. Анализ олигомерных форм ЛФ с помощью гель-хроматографии. Приведены профили оптического поглощения при 280 нМ (А280) препаратов ЛФ, инкубированных в разных условиях. Перед гель-хроматографией ЛФ инкубировали в 50 мM Трис-HCl, рН 7.5, с 50 мМ АТР в отсутствие (синяя кривая) и в присутствии 0,1 M КСl (сиреневая кривая)

Рис. 13. Анализ олигомерных форм ЛФ с помощью гель-хроматографии. Приведены профили оптического поглощения при 280 нМ (А280) препаратов ЛФ, инкубированных в разных условиях. Перед гель-хроматографией ЛФ инкубировали в 50 мM Трис-HCl, рН 7.5, с 50 мМ АМР в отсутствие (синяя кривая) и в присутствии 0,1 M КСl (сиреневая кривая) или 0,15 M КСl (зеленая кривая).

Особенно необычным оказалось поведение ЛФ в присутствии 50 мМ АМР. До добавления соли распределение различных форм ЛФ было сопоставимо с таковым для АТР, за исключением наличия декамерной (754 кДа) формы. Добавление 0,1 М KCl привело к резкому увеличению димерной формы ЛФ, практически полному исчезновению декамера, и исчезновению крупного олигомера с кажущейся мол. массой более 800 кДа (рис. 13). При этом, на профиле хроматографии появилась новая олигомерная форма ЛФ с мол. массой 359 кДа, соответствующая пентамеру. Повышение концентрации КСl до 0,15 М привело к разрушению пентамера и тетрамера и небольшому перераспределению ЛФ между димером и мономером.

С использованием данных гель-хроматографии были оценены массовые доли каждого из олигомеров, образующихся после инкубации ЛФ в различных условиях (табл. 5).

Таблица 5 Относительное содержание различных олигомерных форм ЛФ, образующихся при его инкубации в различных условиях, оцененное из данных гель-хроматографии.

Условия образованияОлигомерная форма* %16мер**Декамер**МономерДимерТетрамерПентамерДекамерБуфер + 1 M NaCl100000000Буфер без соли37,51,760,8001,84,7Буфер +0,1 M KCl4,893,71,5002,05,2Буфер +0,15 M KCl4,095,50,58000,20,6Буфер (Б) + AMP***69,023,47,100,610,526,9Б + AMP + 0,1M KCl29,061,31,68,106,617,0Б +AMP + 0,15M KCl30,068,91,0004,210,8ATP60,136,83,0007,920,1Б +ATP + 0,1 M KCl76,121,12,8008,622,0Б+ATP + 0,15 M KCl39,058,92,2004,411,1Б+Олигосахарид93,45,41,2006,416,3Б +Oc + 0,1 M K Cl16,682,70,7001,53,9Б +Oc +0,15 M KCl12,687,40,030000*Приведены усредненные данные трех независимых экспериментов, ошибка определения приведенных значений не превышала 10-15 %.** Содержание декамера и 16-мера рассчитано теоретически на основании данных СР (см. ниже). ***Б - буфер.

На основании данных Таблицы 5 можно выделить несколько закономерностей:

) Инкубация ЛФ в буфере, не содержащем КСl и других соединений основной формой белка является тетрамер.

) Добавление в раствор ЛФ 0,1 - 0.15 М КСl ведет к разрушению тетрамеров с образованием преимущественно димеров белка.

) В отсутствие соли ATP, АМР и олигосахарид стимулируют образование в основном мономерной формы белка, и в меньшей степени его димера. Добавление соли в присутствии этих лигандов стимулирует образование димерной формы ЛФ и уменьшение тетрамерной формы белка.

) В отсутствие соли только АМР стимулирует заметное образование декамера, а в присутствии 0,1 М КСl происходит образование необычной формы ЛФ, его пентамера.

Следует отметить, что пик белка, соответствующий олигомеру(ам) крупнее декамера (с мол. массой ? 780 -800 кДа) присутствовал в ряде реакционных смесей. Однако в случае анализа олигомерных форм ЛФ с помощью гель-хроматографии он был маленьким во всех случаях кроме АTР и 0,1 М KCl. Учитывая это, во всех случаях содержание этого пика было принято близким к 0. Скорее всего, этот олигомер является неустойчивым и разрушается во время хроматографии.

Следует отметить, что все олигомеры ЛФ являются не очень стабильными и легко разрушаются при добавлении соли. Кроме того, нельзя было исключить, что часть олигомерных форм ЛФ может разрушаться при гель-хроматографии, а взаимодействие молекул ЛФ с сорбентом может стимулировать диссоциацию комплексов белка. Поскольку некоторые пики, соответствующие высокоолигомерным формам, относительно маленькие, а их уменьшение может быть связано с перераспределением белковой плотности между пиками представляется в процессе хроматографии, корректная оценка содержания с помощью гель-хроматографии высокоолигомерных форм белка в растворе представляется не возможной. Одним из методов оценки относительных размеров белков непосредственно в растворе является метод СР. Как указывалось выше, олигомеры ЛФ, содержащие от 1 до 4 мономерных единиц белка, должны относительно слабо рассеивать свет. В то же время, именно олигомерные формы, содержащие больше 4 субъединиц белка, должны вносить максимальный вклад в СР.

3.2Анализ олигомеров ЛФ методом светорассеяния

В экспериментах по СР были использованы те же самые растворы ЛФ, что и для гель-хроматографии. Для каждого раствора были измерены индикатрисы СР (рис. 14). Экстраполируя индикатрисы СР к нулевому углу и пользуясь тем, что I(0)~N*M2, можно оценить среднеквадратичную молекулярную массу в каждой из смесей (рис. 15).

Рис. 14. Анализ светорассеяния олигомерными формами ЛФ, полученными в разных условиях. ЛФ инкубировали в 50 мM Трис-HCl, рН 7.5, содержащем 0,1 М КСl (кривая 1) и один из лигандов: 2 - 5 мМ олигосахарид, 3 - 50 мМ АТР, 4 - 50 мМ АМР.

Рис. 15. Значения корней среднеквадратичных масс для всех исследованных растворов ЛФ. Серии из трех столбиков диаграммы соответствуют: 1 - олигосахарид, 2 - ЛФ в отсутствии лигандов, 3 - АТР, 4 - АМР. В каждой из серий столбики соответствуют: 1 - ЛФ в отсутствие соли, 2 - в присутствии 0,1 M КСl, 3 - в присутствии 0,15 M КСl.

При получении данной оценки считалось, что ЛФ, инкубированный с олигосахаридом в 0,15 M KCl, имеет среднеквадратичную массу 145 кДа (согласно данным гель-хроматографии) и не содержит олигомерных форм большего тетрамера.

Оцененная таким образом среднеквадратичная масса олигомерных форм ЛФ оказалась во всех случаях больше массы, оцененной с помощью гель-хроматографии, а в некоторых случаях она была больше массы тетрамера. Это означает, что долю крупных олигомерных форм, не учтенных при гель-хроматографии (или диссоциировавших в ходе хроматографии), можно оценить с помощью СР.

Очевидно, что при ассоциации могут образовываться различные олигомерные формы ЛФ, содержащие более 4-х мономерных единиц, которые будут рассеивать свет. По данным гель-хроматографии АМР стимулирует достоверное образование декамера, который в присутствии соли диссоциирует до пентамера. По приблизительным оценкам олигомеры с кажущейся мол. массой больше 800 кДа, которые наблюдаются в ряде случаев, могут быть примерно 16-мерами. К сожалению, оценка относительного содержания ассоциатов с разной степенью олигомеризации на основании полученных данных не представляется возможной. В то же время, можно оценить примерное содержание какого-либо одного высокоолигомерного ассоциата, если предположить, что данный ассоциат - единственный крупный олигомер (декамер и больше). На основании численных данных, приведенных на рис. 15, был проведен теоретический анализ возможного содержания 10-мерного и 16-мерного ассоциатов ЛФ в анализируемых растворах белка. Полученные данные приведены в табл. 5.

Интересно, что согласно проведенному анализу данных СР декамер может присутствовать во всех смесях ЛФ, кроме белка инкубированного в буфере, содержащем 1 М КСl. В данной модели анализ теоретического содержания крупных олигомеров проводился путем сравнения с наименее олигомеризованной смесью - ЛФ с олигосахаридом в 0,15 М КСl, т.е. считалось что в данном растворе олигомерный состав соответствует гель-хроматографии). При этом содержание декамера эффективнее всего стимулируется и регистрируется хроматографически только при добавлении АМР, затем (игнорируя содержание более крупных форм даже и зарегистрированных гель-хроматографией) АТР и хуже всего олигосахарида. Добавление 0,1 М КСl приводит к уменьшению содержания в растворе высокоассоциированных форм ЛФ, кроме ЛФ инкубированного с АTP, в котором олигомеризация повышается (согласно гель-хроматографии за счет крупного олигомера, при разрушении тетрамера).

В случае предположения о содержании в растворе только 16-мера ЛФ численные значения уменьшаются примерно в 2-3 раза, но общие закономерности те же самые (Таблица 5).

Таким образом, данные СР свидетельствуют в пользу того, что в растворе, в отсутствие других лигандов, а также в присутствии АТР и АМР может происходить образование высокоолигомерных форм ЛФ, которые, по-видимому, не стабильны и разрушаются в процессе гель-хроматографии на Sepharose.

ЛФ - конформационно активный белок, который может по-разному изменять свою структуру в присутствии лигандов разного типа. Поэтому различная эффективность образования олигомеров различной степени олигомеризации и стабильности, обнаруженные с помощью данных СР и гель-хроматографии (табл. 5) может свидетельствовать в пользу того, что под действием разных лигандов и в их отсутствии образуются олигомеры с разным типом организации. В пользу того, что олигосахарид, АТР и АМР стимулируют образование олигомеров ЛФ разного типа свидетельствуют данные о различной стабильности белковых ассоциатов, образующихся в присутствии этих лигандов. Так согласно данным СР, олигомерные формы ЛФ, образованные в присутствии АТР, разрушаются до мономеров в присутствии 50 мМ MgCl2 в течение 25 мин. в то время как АМР-зависимые комплексы в этих условиях достаточно стабильны (данные не приводятся).

С помощью индикатрис светорассеяния можно так же оценить средний радиус инерции для набора частиц, содержащихся в каждом из растворов. рис. 14 приведены данные по СР растворами ЛФ, инкубированными в различных условиях. С помощью уравнения Гинье средний радиус инерции (Rg) для ЛФ, инкубированного с ATP в присутствии 0,1 M KCl составил 41 ± 3 нм, а для ЛФ инкубированного с AMP в 0,1 M KCl - 40 ± 3 нм. Эти величины существенно больше величины Rg = 26.7 Å, найденного с помощью МУРР для мономера ЛФ. Поскольку основной вклад в СР вносят крупные по размеру частицы, то эти значения Rg можно считать нижней оценкой размеров крупных олигомеров.

3.3Анализ олигомеров ЛФ методом абляции

Одним из современных методов исследования мол. масс белков является МАЛДИ. Однако, этот метод исследования является достаточно жестким и при переходе нанесенных на носитель белков в газовую фазу происходит частичное разрушение белковых молекул. В связи с этим метод МАЛДИ не пригоден для исследования белковых олигомерных комплексов, в которых субъединицы обычно связаны слабыми нековалентными электростатическими, гидрофобными, Ван-дер-ваальсовыми взаимодействиями и водородными связями. Метод абляции различных соединений с твердых подложек существенно мягче, чем МАЛДИ, по условиям переведения соединений в газовую фазу. В настоящее время сотрудниками ИЦиГ и ИКХиГ СО РАН показано, что пероксидаза хрена может быть аблирована из лиофилизованного состояния и при этом она сохраняет свою каталитическую активность.

В данной работе впервые были сделаны попытки проанализировать на примере комплексов ЛФ возможность анализа олигомерного состояния белков с помощью метода абляции. Сначала были проведены эксперименты по абляции некоторых стандартных белков из лиофилизованного состояния. В качестве подложки для лиофилизации использовали силуфольные пластины. Растворы белков наносили на поверхность пластин, содержащих слой силикагеля и на обратную - чистую сторону алюминиевой пластины. Образцы, нанесенные на пластины, замораживали над жидким азотом и затем подвергали абляции. Было показано, что абляция белков с поверхности, содержащей силикагель, приводит к появлению в спектре в основном частиц с мол. массой, соответствующей использованным белкам. В то же время использованные белки в этом случае подвергались частичной деструкции. В то же время при абляции белков с алюминиевой поверхности заметной деструкции белков не наблюдалось. Аналогичные данные были получены при абляции комплексов ЛФ с силуфольной и алюминиевой поверхности. На рис. 16 приведен спектр белковых частиц, соответствующий комплексу ЛФ после его инкубации в нейтральном буфере в отсутствии соли.

Основной формой ЛФ в случае силуфола (рис. 16а) является тетрамер; димер и мономер не разделились. Наличие частиц в спектре частиц с размером менее 5 нм позволяет предположить, что произошло разрушение не только олигомеров крупнее тетрамера, но так же и разрушение мономера.

При абляции ЛФ с алюминиевой подложки (рис. 16б) и при меньшей интенсивности излучения, мономер и димер не были обнаружены, но удалось зарегистрировать крупные олигомеры с размером порядка 103 нм, что согласуется данными светорассеяния. При условии что еще более крупные олигомеры не "развалились", это может означать, что растворы ЛФ могут содержать ассоциаты типа 16-меров (или больше). Таким образом очевидно, что абляция с алюминиевой подложки более перспективна для исследования нековалентных олигомерных комплексов белков.

Рис. 16. Абляция ЛФ инкубированного в буфере. а) ЛФ аблироавнный с силуфола, б) ЛФ аблированный с алюминиевой подложки.

В то же время нельзя исключить, что лиофилизация на алюминиевой подложке может вести к стабилизации высокоолигомерных комплексов ЛФ, что ведет к исчезновению комплексов меньшего размера, обнаруженных при абляции ЛФ с силуфола и методом гель-хроматографии. В то же время, обнаружение частиц с размером меньше 5 нм при абляции с силуфола может свидетельствовать в пользу разрушения высокоолигомерных комплексов ЛФ при их взаимодествии с силуфолом

3.4Обсуждение результатов

В данной работе было проведено исследование олигомерных форм ЛФ с помощью четырех различных методов. Согласно литературным данным, ЛФ существует в виде двух основных олигомерных форм - мономера и тетрамера. С помощью метода гель-хроматографии в данной работе впервые показано, что в нейтральном буфере в отсутствии соли основной формой белка, устойчивой в условиях хроматографии на Sepharose, действительно является тетрамер, который эффективно диссоциирует до димеров и мономеров после добавления КСl (рис. 10). Нами также впервые показано, что что по данным гель-хроматографии природные лиганды ЛФ (олигосахарид, АТР и АМР) в отсутствие соли понижают степень олигомеризации ЛФ, стимулируя образование преимущественно димерной (АТР и АМР) или мономерной (олигосахарид) формы белка (рис. 11-13), одновременно (по данным СР) повышая сренеквадратичную массу (рис. 14) за счет образования крупных ассоциатов - декамера и предположительно 16 мера..

Интересно, что добавление КСl по-разному влияет на лиганд-зависимую олигомеризацию ЛФ. Олигосахарид в присутствии соли стимулирует образование димера (рис. 11), ATP разрушает тетрамерную и димерную форму ЛФ, и единственный повышает долю крупного олигомера (рис. 12), а в присутствии АМР происходит формирование димера и пентамера (рис. 13). Однако, это все касается форм ЛФ, в той или иной степени устойчивых в условиях гель-хроматографии. Следует полагать, что высокоолигомерные формы ЛФ, которые обнаружены в растворах белка с помощью СР, скорее всего, не устойчивы в условиях гель-хроматографии и разрушаются либо при контакте с сорбентом в самом начале хроматографического процесса, либо в процессе гель-хроматографии. В пользу такого разрушения может указывать наличие "длинного размазанного хвоста" у пика с мол. массой 754 кДа (рис. 13), соответствующего ЛФ, инкубированному с АМР в отсутствие соли. Данные по гель-хроматографии в целом плохо согласуются с данными СР, всегда показывая меньшую олигомеризацию.

Методом СР были обнаружены крупные олигомеры и оценены их радиусы инерции (рис. 14). Согласно этим данным в растворе ЛФ присутствует в гораздо более высокоолигомерном состоянии, чем следует из данных по гель-хроматографии. Согласно данным СP (рис. 15) все лиганды: олигосахарид < АТР < АМР, в отсутствие KCl стимулируют образование олигомерных форм ЛФ. При этом добавление KCl ведет к примерно одинаковому уменьшению степени олигомеризации ЛФ в буфере содержащем и не содержащем олигосахарид. В то же время, АТР-зависимая степень олигомеризации в присутствии 0,1 М КСl даже несколько больше, чем в отсутствии соли и слабо понижается при повышении концентрации соли до 0,15 М (рис. 16). Максимальный уровень олигомеризации, наблюдаемый в присутствии АМР, постепенно понижается после добавления 0,1 М КСl, а затем 0,15 М соли. Однако, он остается высоким и сопоставимым с таковым для ЛФ в отсутствие соли и других лигандов, даже при добавлении 0,15 М КСl (рис. 15). Это свидетельствует о том, что олигомерные формы ЛФ, существующие в растворе, не стабильны и разрушаются при контакте с Sepharose 4В в процессе гель-хроматографии.

Данные по оценке олигомерных форм с помощью абляции лиофилизованных препаратов ЛФ с алюминиевой подложки также могут свидетельствовать в пользу наличия в растворе высокоолигомерных форм ЛФ по размеру соответствующих как минимум 16-меру. В целом, данные СР и абляции приводят к сопоставимым результатам, подтверждающим наличие крупных олигомеров.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Методом гель-хроматографии впервые проведен анализ олигомерных форм лактоферрина (ЛФ), которые образуются под действием его природных лигандов. Показано, что в нейтральном буфере при низкой ионной силе основной формой лактоферрина, устойчивой в условиях хроматографии, является тетрамер, диссоциирующий до димеров и мономеров после добавления 0,1 М КСl. АТР и АМР в отсутствие соли стимулируют образование преимущественно димерной, а олигосахарид - мономерной формы белка. Олигосахарид в присутствии соли КСl стимулирует образование димера, ATP разрушает тетрамерную и димерную форму ЛФ, а в присутствии АМР происходит формирование димера и необычной формы лактоферрина - пентамера.

2. Методом светорассеяния исследована эффективность образования олигомеров в присутствии и отсутствии различных лигандов и показано, что лактоферрин в присутствии АТР и АМР образует высокоолигомерные формы. Согласно средним радиусам инерции этих олигомеров они могут содержать в своем составе до 10 и более мономеров ЛФ.

. Впервые исследованы олигомерные формы лактоферрина методом лазерной абляции. Данные светорассеяния и абляции приводят к сопоставимым результатам, подтверждающим наличие в растворах лактоферрина крупных по размеру олигомеров лактоферрина. Сравнение данных гель-хроматографии, светорассеяния и лазерной абляции свидетельствует в пользу того, что высокоолигомерные формы лактоферрина могут разрушаются при их контакте с сорбентом в процессе хроматографии.

Список литературы

лактоферрин дифракция олигомерный аббеляция

Birgens, H. Lactoferrin in plasma measured by an ELISA technique: evidence that plasma lactoferrin is an indicator of neutrophil turnover and bone marrow activity in acute leukaemia (1985) Scand. J. Haematol., 34(4), 326-331., H. Lactoferrin in plasma measured by an ELISA technique: evidence that plasma lactoferrin is an indicator of neutrophil turnover and bone marrow activity in acute leukaemia (1985) Scand. J. Haematol., 34(4), 326-331., P.F., Viljoen, M. Lactoferrin: a general review. (1995) Haematologica., 80(3), 252-267.

Отт В.Д., Дюкарева С.В., Мельников О.Р. Лактоферрин и перспективы его использования в алиментарной профилактике анемий. (1993) Вопр. Питания, 1, 6-13., E.D. Human lactoferrin: a novel therapeutic with broad spectrum potential. (2001) J. Pharm. Pharmacol. 53(10), 1303-10.

. Metz-Boutigue, M.H., Jolles, J., Mazurier, J., Schoentgen, F, Legrand, D., Spik, G., Montreuil, J., and Jolles, P. Human lactotransferrin: amino acid sequence and structural comparisons with other transferrins. (1984) Eur. J. Biochem., 145, 659., G.B., Anderson, B.F., Norris, G.E., Thomas, D.H., Baker, E.N. Structure of human apolactoferrin at 2.0 A resolution. Refinement and analysis of ligand-induced conformational change (1998) Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr., 54, 1319-1335., D., Salmon, V., Coddeville, B., Benaissa, M., Plancke, Y., Spik, G. Structural determination of two N-linked glycans isolated from recombinant human lactoferrin expressed in BHK cells (1995) FEBS Lett., 365(1), 57-60.Berkel, P.H., van Veen, H.A., Geerts, M.E., de Boer, H.A., Nuijens, J.H. Heterogeneity in utilization of N-glycosylation sites Asn624 and Asn138 in human lactoferrin: a study with glycosylation-site mutants (1996) Biochem. J., 319, 117-122.Berkel, P.H., Geerts, M.E., van Veen, H.A., Kooiman, P.M., Pieper, F.R., de Boer, H.A., Nuijens, J.H. Glycosylated and unglycosylated human lactoferrins both bind iron and show identical affinities towards human lysozyme and bacterial lipopolysaccharide, but differ in their susceptibilities towards tryptic proteolysis (1995) Biochem. J., 312, 107-114., N., Retequi, L., Masson, P. . Comprasion on human lactoferrins from milk and neutrophilic leucocytes. Relative molecular mass, isoelectric point, iron-binding properties and uptake by the liver. (1985) Biochem. J., 229, 353-359., M.S., Smith, C.A., Ainscough, E.C., Baker, H.A., Brodie, A.M., Baker, E.N. Anion binding by human lactoferrin: results from crystallographic and physicochemical studies. (1992) Biochem. J., 31, 4451-4458. , L. A., and Lonnerdal, B. Fe-saturation and proteolysis of human lactoferrin: effect on brush-border receptor-mediated uptake of Fe and Mn. 1989 Dec;257(6 Pt 1):G930-4. J., SpikG. Comparative study of the iron-binding properties of human transferring. Complete and sequential iron saturation and desaturation of the lactotransferrin. 1980 Biochim. Biophys. Acta, 629, 399-408., M., Brock, J.H., Iron in immunity. Cancer and Inflammation (1989) John Wiley & Sons., R.M., Bagby, G.C., Davis, J. (1981) Calcium-dependent polymerization of lactoferrin Biochem. Biophys. Res. Commun., 101(1), 88-95., G.C.Jr., Bennett, R.M. Feedback regulation of granulopoiesis: polymerization of lactoferrin abrogates its ability to inhibit CSA production (1982) Blood, 60(1), 108-112., C., Miyazawa, K., Broxmeyer, H.E. Physical characteristics and polymerization during iron saturation of lactoferrin, a myelopoietic regulatory molecule with suppressor activity (1994) Adv. Exp. Med. Biol., 357, 121-132., A., Kuyas, C., Haeberli, A. Oxidative radioiodination damage to human lactoferrin. (1986) Biochem. J., 240, 239-245.

Semenov, D.V., Kanyshkova, T.G., Buneva, V.N., Nevinsky, G.A. Human milk lactoferrin binds ATP and dissociates into monomers. (1999) Biochem. Mol. Biol. Int., 47(2), 177-84., J.H. N-terminal stretch Arg2, Arg3, Arg4 and Arg5 of human lactoferrin is essential for binding to heparin, bacterial lipopolysaccharide, human lysozyme and DNA. (1997) Biochem. J., 328, 145-151)

He, J., Furmanski, P. Sequence specificity and transcriptional activation in the binding of lactoferrin to DNA. (1995) Nature, 373, 721-724.

Kanyshkova, T.G., Semenov, D.V., Buneva, V.N., Nevinsky, G.A. Human milk lactoferrin binds two DNA molecules with different affinities. (1999) FEBS Lett., 451, 235-237S.E., Nevinsky G.A. Lactoferrin interacts with nucleotides. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2004. 23(6&7), 1043-1046

Georgy A. Nevinsky and Svetlana E. Babina. Human lactoferrin and its polyfunctional biological functions. In Protein Structure. Kaleidoscope of Structural Properties and Functions (Ed. V. N. Uversky), Research Signpost, 2003, 499-530

Furmanski, P., Li, Z.P., Fortuna, M.B., Swamy, C.V., Das, M.R. Multiple molecular forms of human lactoferrin. Identification of a class of lactoferrins that possess ribonuclease activity and lack iron-binding capacity (1989) J. Exp. Med., 170, 415-429.

Furmanski, P., Li, Z.P. Multiple forms of lactoferrin in normal and leukemic human granulocytes. (1990) Exp. Hematol. 18(8), 932-935.T.G., Babina S.E., Semenov D.V., Isaeva N., Vlassov A.V., Neustroev K.N., Kulminskaya A.A., Buneva V.N., Nevinsky G.A. Multiple enzymic activities of human milk lactoferrin. Eur. J. Biochem. 2003. V. 270. P. 3353-3361.

Бабина С.Е., Канышкова Т.Г., Бунева В.Н., Невинcкий Г.А. Лактоферрин - дезоксирибонуклеаза человеческого молока. Биохимия. 2004. 69(9), 1239-1250.

Бабина С.Е., Семенов Д.И., Бунева В.Н., Невинcкий Г.А. Лактоферрин грудного молока гидролизует рибонуклеозид-5'-трифосфаты. Молекуляр. биол., 2005. 39(3), 513-520.F.V., Zinoviev V.V., Vavilin V.I. and Malygin E.G. Application of the Small-Angle X-ray Scattering technique for the study of two-step equilibrium enzyme-substrate interactions. Biopolymers. 1996. V.38. P.131-139.31

Гилл Ф., Мюррей У., Райт М. 1985. Практическая оптимизация. М.: Мир., 509с.

Тузиков Ф.В. Анализ биологических наноструктур в системах метаболизма белков и липидов: строение, дисперсный состав и механизмы равновесных взаимодействий макромолекул. Дисс. на соиск. уч. степ. д.б.н. 20005. Новосибирск. 364с.

Анализ комплексов лактоферрина молока человека ВВЕДЕНИЕ 1.Обзор Литературы 1.1Строение и физико

Больше работ по теме: